Summary
이 보고서에서 우리는 개발 신장의 줄기 / 전구 세포를 조절 신호 경로를 연구하는 데 사용할 수있는 배아 마우스 신장에서 전구 세포의 틈새의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 이러한 교양 세포가 작은 분자 및 재조합 단백질 치료에 매우 접근하고 있으며, 또한 중요한 후보 경로의 효율적인 조작을 허용 바이러스 전달에.
Abstract
신장의 배아 개발 광범위 organogenesis의 상피 - mesenchymal 상호 작용을위한 모델로하고 선천성 신장 질환의 기원의 이해를 얻기 위해 두 연구되었습니다. 최근 nephrogenic 운명 향해 순진한 배아 줄기 세포를 핸들의 가능성은 재생 의학의 새로운 분야에서 살펴되었습니다. 마우스의 유전자 연구가 신장 개발에 필요한 몇 가지 경로를 파악해야하고, 장기에서 유전자 전사의 글로벌 카탈로그는 최근 생성되었습니다 http://www.gudmap.org/을 필수 발달 기능의 수많은 후보 레귤레이터를 제공합니다. 쥐 신장의 Organogenesis는 장기 문화를 공부 할 수 있으며, 여러 보고서 중 후보 단백질을 적용하거나 siRNA 또는 morpholinos를 사용하여 후보 유전자의 표현을 쓰러뜨린의 결과를 분석하기 위해이 방법을 사용했습니다. 교양 장기 macromolecules 및 바이러스 입자의 소형 세포외 기질 제한 확산을 포함 그러나 개발 신장에 줄기 / 전구 세포의 차별 대 갱신을 조절 신호의 연구 기관 문화의 적용이 제한됩니다. 우리가 분화의 상피 유도에서 격리 개발 신장 전의 생체내의 nephrogenic 영역 또는 전구 세포의 틈새를 수립 차 전지 시스템을 개발했습니다 신장에서 줄기 / 전구 세포의 틈새에 영향을 미치는 이벤트를 신호 세포를 연구합니다. 제한 효소 소화 사용 nephrogenic 영역 전지는 E17.5에서 신장을 개발로부터 해방 선택하실 수 있습니다. 여과 후,이 세포가 최적의 조건을 사용하여 불규칙한 monolayer로 교양 수 있습니다. 마커 유전자 분석은 이러한 문화가 생체내에 nephrogenic 영역의 특성 세포 유형의 분포를 포함하는 것을 보여줍니다, 그들은 문화의 기간 동안 적절한 마커 유전자 발현을 유지. 이 전지는 작은 분자 및 재조합 단백질 치료에 매우 접근하고 있으며, 중요한 것은 역시 크게 후보 줄기 / 전구 세포 조절 효과의 연구를 용이하게 바이러스 전달에. 이러한 증식과 세포 죽음뿐만 아니라 생체내의 nephron의 줄기 / 전구 세포의 특성을 분자 마커의 표현의 변경과 같은 기본적인 세포 생물 학적 매개 변수가 성공적으로 실험 결과로 사용할 수 있습니다. 이 소설 일차 전지 기술을 사용하여 우리 연구실에서 진행중인 작업은 nephron의 줄기 / 전구 세포의 자기 갱신 대 분화의 규정을 관할 기본적인 메커니즘을 발견하는 것을 목표로하고있다.
Protocol
1. 신장 소화를위한 시약 준비
- 0.25 %의 Collagenase 1.5 ML은 (W / V), 1 % Pancreatin 다이제스트 (W / V) 솔루션은 8 E17.5 신장에서 nephrogenic 영역 전지 (NZCs)의 추출에 필요한 것입니다. Pancreatin은 상온에서 분해하기 위해 약 2 시간이 소요되기 때문에 충분한 사전 실험되어야 예상 배아 신장의 최대 번호에 대한 솔루션을 소화. 첫번째 25 Collagenase의 MG 10 ML Dulbecco의 인산 분명 15 ML, 멸균 원심 튜브에 살린 (DPBS)를 버퍼 수 있습니다.을 추가하여 솔루션을 소화 준비 이것이 효소 소화에 영향을 줍니까로 DPBS이 칼슘이나 마그네슘을 포함하지 않는 것이 중요합니다. Collagenase A. 적어도 2 시간 해산 Collagenase nutator에 솔루션과 섞어 Pancreatin 100 MG 추가 해산 10 분 nutator에 솔루션을 섞는다. 또는, Collagenase A / Pancreatin 다이제스트 솔루션은 4 박 nutator에서 혼합 수 있습니다 ° C. 이것은 당신이 Collagenase와 Pancreatin은 무게 동안 대기 중으로 쉽게 분산과 비강을 짜증나게 수 있으므로, 마스크를 착용하는 것이 좋습니다.
- 행크의 버퍼 생리 식염수 (HBSS)에 5 %의 태아 소 혈청 (FBS) (V / V) 솔루션을 준비합니다. 섞어 반전. 8 신장의 각 튜브 1 ML이 필요합니다.
- 1 % 글루타민 (V / V), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (PenStrep) (V / V)와 Keratinocyte 혈청 무료 매체를 보완하여 문화 매체를 준비합니다.
- 성장 표면의 cm 2 당 5 밀리그램의 농도에 인간 fibronectin 솔루션 코트 살균 평면 바닥 폴리스티렌 조직 문화 플레이트 (96, 48, 24 또는 잘 6). fibronectin 가루 5 MG는 무균 H 2 O. 5 ML에 resuspended입니다 이것은 칼슘이나 마그네슘없는 무균 DPBS에 1시 25분을 희석하고 250 ML은 24 잘 접시의 각각의 잘에 추가됩니다. 번호판은 다음 4 ° C. 또는 1 시간 뒤에 1 시간 동안 실온에서 fibronectin 솔루션과 함께 incubated 있으며, 접시는 4 밤새 incubated 수 있습니다 ° C. 솔루션은 다음 층류 후드에 aspirated입니다 전에 중간 /의 이외에도 세포.
2. 해부 신장 및 제거 캡슐 (실온에서 완료)
- E17.5에서, 귀하의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 승인 절차를 사용하여 어머니를 희생 자궁을 제거하고 칼슘, 마그네슘과 DPBS를 포함하는 페트리 접시에 놓으십시오. 해부 현미경, 자궁에서 각 배아를 제거하고 각각의 배아를 참살하는 시계 '집게를 사용합니다. 전체 쓰레기가 자궁 밖으로되면, 칼슘, 전적으로 가능한 한 많은 혈액과 조직 부스러기처럼 뒤에 떠나는 배아를 충당하기 위해 마그네슘과 충분한 DPBS가 포함된 깨끗한 페트리 접시에 배아를 전송합니다.
- 포셉를 사용하여 배꼽의 수준에있는 배 (胚)의 복벽에 원주 절개합니다. 그런 다음, 그 뒷면에있는 배아를 배치 포셉 한 세트와 함께 어깨에 내려 핀, 아래 포셉의 다른 세트를 사용하여 방광에 폐에서 내장을 제거합니다. 연습이 한 동작으로 할 수 있습니다. 신장은 장기의 질량의 뒷면에 첨부해야합니다. 신장이 eviscerated 기관에 연결된 유지하지 않으면, 그들은 조심스럽게 등의 신체 벽에서 제거할 수 있습니다. 그들이 부적 절한 세포 유형과 최종 문화를 오염시킬 수 있으므로 이러한 해부 과정에서 손상되었을 신장은 폐기되어야합니다.
- 부드럽게 서로 연결된 신장을주의한다, 장기의 나머지 부분에서 신장을 떨어져 애타게. 포셉 한 세트로 신장 사이의 조직을 잡고 다른 포셉과 신장 중 하나에 연결된 부신 (副 肾)를 잡아. 부신 (副 肾)이 신장 캡슐에 첨부해야합니다. 부드럽게 부신 (副 肾)과 멀리 바나나 필링과 비슷한 신장의 외부 주위에서 캡슐 껍질. 필링 동안 절반으로 신장을 분할하고, 캡슐 아래 신장 조직을 손상하지 않도록되지 않도록 조심 해요. 조심스럽게 남아있는 캡슐뿐만 아니라 여전히 연결된 경우 ureter를 제거합니다. 나머지 신장과 함께 반복합니다.
- HBSS의 5 ML의 폴리스티렌 관에 신장을 배치 상처 전송 pipet을 사용합니다. 반복 각 배아에 대한 2.2-2.4 단계를 반복합니다. 신장은 튜브 당 8 풀링 수 있습니다. 연습, 해부 및 캡슐 제거를 통해 배아 당 2-3분 소요됩니다.
3. 신장의 효소 소화 (그렇지 않으면 표시되지 않는 실온에서 모든 단계)
- 신중하게 신장과 접촉을 피하고 동안 pipettor과 신장을 포함하는 5 ML 튜브의 HBSS 용액을 제거합니다. 즉시 Collagenase 다음 예제로 이동하기 전에 신장을 포함하는 5 ML 튜브로 A / Pancreatin 다이제스트 솔루션 1.5 ML를 추가합니다. 신장의 각 튜브에 대해 반복합니다.
- 효소 / 신장과 함께 플레이스 튜브는 15 분 동안 미리 예열 37 ° C 배양기에서 nutator에 요약. 이분 이전다이제스트의 완성, 수행중인 각 소화 하나의 신선한 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 DNase 3 μl (1 U / ML)을 추가합니다.
- 신속하게 제거 인큐베이터에서 소화, FBS의 75 μl를 추가하고 섞어 3 번 반전. 2 분 동안 벤치에 서 보자.
- 나머지 0.2 ML 세포 현탁액과 뒤에 신장을 떠나는 동안 DNase (1 U / ML)이있는 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 세포 현탁액의 1.4 ML을 전송합니다. 솔루션의 추가 0.2 ML 같은 세포외 기질과 같은 불순물을 포함합니다 남아.
- 미리 예열 37 10 분 ° C 배양기에서 nutator에 혼합 세포 현탁액 / DNase.
- 신속 인큐베이터에서 셀 suspensions를 제거하고 1.5 ML Eppendorf 튜브에 각각 전송할 수 있습니다. 5 분 325g에 microfuge의 세포 suspensions를 스핀.
- 5-6 번하고 아래로 pipetting 5 % FBS / HBSS 1 ML에서 세포 펠릿 및 resuspend 펠렛에서 뜨는 제거합니다. 다음 예제로 이동하기 전에 각각의 튜브 캡.
- 5 분 325g에서 microcentrifuge에서 셀 suspensions를 스핀.
- 뜨는을 제거하고 다음 예제로 이동하기 전에 각각의 튜브에 첨가제와 캡 튜브로 Keratinocyte 혈청 무료 매체 (KSFM)의 0.5 ML를 추가합니다. 매체는 모든 튜브에 추가되었습니다 후, 부드럽게 1ml micropipette로 5-6 회를 pipetting 아래 각 세포 펠렛을 resuspend. 신선한 5 ML의 폴리스티렌 튜브의 모든 세포 suspensions을 결합합니다.
- 샘플 당 KSFM와 5 ML의 폴리스티렌 원형 바닥 관에 위치 서부 유럽 표준시 사전이 40 미크론 셀 스트레이너 모자. 1 ML의 micropipette로 전송 한 셀 스트레이너 캡을 통해 세포 suspensions 패스. 피펫 팁으로 필터를 감동하지 마십시오. 흐름 -을 통해 수집하고 두 번째 여과기 뚜껑을 통해 여과를 반복합니다. 셀 스트레이너 뚜껑을 제거하고 정상 5 ML의 폴리스티렌 관에서 새 모자로 바꿉니다.
- 첨가제와 KSFM와 필요한 diluting, hemocytometer 또는 cm 2 당 100,000-200,000 세포의 밀도에 fibronectin 코팅 문화 판의 우물에 장치 및 전송 세포를 세고 다른 세포와 세포를 계산합니다. 일반적으로, 우리는 10 배아 쓰레기 약 4.5x10 6 세포를 검색할 수 있습니다.
- 37 세포를 품어 ° C 5% CO 2 humidified 보육.
- 세포가 회복 및 추가 시약과 함께 이전에 자극에 매체 2~4시간 위해 첨부할 수 있습니다. 1-48시간에 대한 관심의 화합물로 세포를 자극. 제조 업체의 지침에 따라 Qiagen RNeasy 마이크로 키트를 사용하여 PCR 분석을위한 RNA를 정화하거나 찬란 세포를 immunostain 아래 지침을 따르십시오.
4. 셀의 고정을위한 시약을 준비하고 Immunostaining
- 4퍼센트 PFA 준비 : 55에서 PBS (V / V)에 4 % paraformaldehyde를 해산 ° C 정기적으로 동요와 함께. 사용하기 전에 실온에 쿨. 이 솔루션은 독성이며, 지정 폐기물 용기에 폐기해야합니다.
- 0.3 % (V / V) 솔루션을 얻기 위해 PBS에 트리톤 X - 100을 추가하여 permeabilization 솔루션을 준비합니다.
- 사용할 차 항체를 마련하는 데 사용한 것과 같은 종류의 혈청과 PBS에 5 %의 차단 솔루션을 준비합니다. 당신은 당나귀 방지 래빗 알렉사 플루어 568를 통해 타겟 항원에 대한 토끼 항체를 감지하는 경우 예를 들어, 5 % 당나귀 혈청을 포함하는 차단 솔루션을 준비합니다. 4 스토어 ° C.
- 5% 차단 솔루션 항체의 적절한 농도를 추가하여 기본 항체 솔루션을 준비합니다.
- 사용하기 바로 전에 차 항체 용액을 준비합니다. 핵 counterstain DAPI와 같은 5% 차단 솔루션 phalloidin 같은 다른 organelle 마커와 함께 제조 업체의 권장 농도에 형광단 복합 항체를 추가합니다. 스토리지가 필요한 경우, 4 어둠의 솔루션을 유지 ° C를 사용까지.
- immunostained 세포의 저장을위한 50 % 글리세롤 / PBS 용액 (V / V)를 준비합니다. 또는 Vectashield 사용할 수 있습니다.
5. 셀의 고정 및 Immunostaining
- 다음 프로토콜은 24 잘 접시에 NZCs의 고정 및 얼룩을 위해 설계되었습니다. 주어진 볼륨은 단일 잘위한 것입니다. 시약은 부드럽게 세포의 분리를 피하기 위해 모든 단계 동안 pipetted되어야하고, 평판 교반는 인큐베이션 단계에서 사용하지 않는 것이 좋습니다.
- 부드럽게 1 ML micropipette와 매체를 제거하고 부착 교양 세포 4% PFA 0.5 ML를 추가합니다. 상온에서 그대로 15 분 동안 품어.
- 4퍼센트에게 PFA를 제거하고 0.5 ML 당 우물의 permeabilization 솔루션을 추가합니다. 실온에서 10 분 알을 품다.
- permeabilization 솔루션을 제거하고 부드럽게 씻어 당 PBS 0.5 ML로 두 번 씻어.
- 솔루션을 차단 0.5 ML를 추가하고 60 분 실온에서 알을 품다.
- 차단 솔루션을 제거하고 0.225 ML 차 항체 솔루션을 추가합니다.
- 4에서 2 시간 또는 숙박에 대해 실온에서 품어 ° C.
- 기본 항체 솔루션을 제거하고 부드럽게 도리린스 당 PBS 0.5 ML로 두 번 nse.
- 0.225 ML 차 항체 솔루션을 추가합니다. 60 분 상온에서 어둠의 번호판을 품어.
- 차 항체 용액을 제거하고 부드럽게 씻어 당 PBS 0.5 ML로 두 번 씻어.
- 50 % 글리세롤 / PBS 용액 (V / V) 또는 잘 표면의 바닥을 감추기에 충분 할만큼 Vectashield의 0.3 ML를 추가합니다.
- epifluorescence 현미경하거나 저장과 이미지 전지는 4 호일에 싸여 ° C.
6. 대표 결과
그림 1. NZCs이 cm 2 당 200,000 개 셀로 도금, E17.5 배아에서 정화 및 24 시간 총 37 ° C에서 incubated했다. 세포 immunofluorescent 얼룩하기 전에 Leica DM의 IRB 거꾸로 현미경으로 위상 대조적으로 몇 군데 있었다. 문화 24 시간 이후 NZCs의 (A) 20X 위상 콘트라스트 볼 수 있습니다. (B) 세포 고정과 nephron의 전구 세포에 대한 구체적인 토끼 방지 PAX2 항체 (적색)과 보조 알렉사 플루어 568 복합 당나귀 방지 토끼를 사용하여 얼룩되었습니다. 블루 핵은 DAPI와 counterstained합니다. 문화 24 시간 후에 nephron의 progenitors의 클러스터 (C) 40X 위상 콘트라스트보기 (중심). (D) LacZ + Foxd1 모터의 제어하에 β - galactosidase를 표현 Foxd1 LacZ 스트레인의 배아. Foxd1에서 격리 NZCs의 40X 이미지는 개발 신장의 nephrogenic 구역 내에서 stromal 세포 인구 표시됩니다. 세포는 F - 굴지 마커 phalloidin (오레건 녹색 차 공액), 핵 얼룩 DAPI (블루)와 토끼 방지 β - galactosidase 물들일 했어요 - Foxd1의 검출을위한 (보조 알렉사 플루어 당나귀 안티 래빗 568) + stromal 세포 ( 빨간색).
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Discussion
이 프로토콜에서는 배아 신장의 nephrogenic 영역에서 세포를 분리하여 문화하는 방법을 설명합니다. 그것은 처음 nephrogenic 영역 (빈 외., 2009)의 세포에 BMP7 치료의 효과에 관한 연구의 일환으로 출판하는 방법의 개발이다. 초기 연구에서는 NZC 인구 내에서 대표 셀 유형을 특성화하기 위해 일련의 실험을 실시했다. (스리 니 바스 외, 2001.; 유 외를, 간단히, 대뇌 피질의 기질 (Foxd1 + / lacZ) (. Hatini 외, 1996)에 대한 유전 기자의 NZCs의 정화는 (R26 rEYFP Hoxb7 + / CRE) 덕트 수집. , 2002), 그리고 모자 mesenchyme이 (Bmp7 + / lacZ) (고딘 외., 1998) 수확 NZCs의 약 35 %가 대뇌 피질의 기질 것을 밝혀, 52 %는 캡 mesenchyme하고 덕트 오염을 수집하는 것은 이하의 0.04 %를 나타냄. R26 rEYFP 변형 (옥스 버그 외, 2004,,.. 스리 니 바스 외, 2001) Bmp7 + / CRE를 사용하여 실험을 표시 리니지 NZCs의 약 10 % Bmp7 표현을 차별하고 잃어버린 캡 mesenchyme의 혈통의 세포 수 있습니다 것을 보여주었다 . 7AAD과 생존 연구는 약 95 % 고립 NZCs의 생존율을 보여주었다. 우리는 최근 흐름 cytometric 정렬을 통해 NZCs 이내 세포 subpopulations를 분리에서 성공을 경험했습니다. 그러나, nephrogenic 영역의 subpopulations 각 구체적인 멤브레인 - 관련 마커의 소수는 이러한 분석을 제한하고 있으며, 형광 마커 유전자를 나르는 생쥐에서 파생된 현재 세포가 가능합니다.
이 프로토콜의 효능은 해부 단계에서 속도에 크게 의존합니다. 신장이 효소 소화되기 전에 시간의 짧은 기간 동안 HBSS에 남아있는 성장 인자의 자극 증가로 세포 생존과 응답 모두. 짧은 준비 시간이 있으므로 높은 세포 생존 능력과보다 강력한 대응을 모두 발생합니다. 세포 펠렛 쉽게 상당한 세포의 손실의 결과로 정신적으로 세포 현탁액을 회전 후 뜨는 제거하면 또한주의해야합니다.
배아 장기 문화 (Grobstein, 1953a; Grobstein, 1953b) 설명 클리포드 Grobstein의 초기 작품부터, 신장은 organogenesis 및 개발에 상피와 mesenchymal 세포 사이의 상호 작용을위한 모델 시스템을하고 있습니다. 최근 microanatomic 유전자 발현 연구는 이러한 세포 구획의 각 (브런스킬 외., 2008) 내에서 세포 유형의 예기치 못한 복잡성을 밝혀 있고, 같은 NZC 문화 등 상호 보완적인 방법은 nephrogenesis 동안 이러한 세포 사이의 상호 관계를 이해해야합니다. 우리의 기본 세포 조사의 궁극적인 목표는 nephrogenic 영역 세포가 무한정 모두 성인에 nephrogenesis 및 engraftment 연구를위한 체외로 확대 될 수있는 조건을 정의하는 것입니다. NZC 문화 시스템은 이러한 세포 성장 조절의 메커니즘을 정의하기 위해 실험실 목표에서이 목표를 향해 중요한 단계, 및 지속적인 연구이다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIDDK (LO), 미국 심장 협회 (AB), 스웨덴 및 Kungliga Fysiografiska Sällskapet, 룬드, 스웨덴 (UB)의 웬너 - Gren기구에서 박사 후 장학금에서 R01 DK078161에 의해 지원되었다. 추가 지원은 조직 병리학, 생물 정보학 및 외과를위한 메인 메디컬 센터 연구소의 핵심 시설 (2P20RR18789 - 06 지원)와 MMCRI 동물 시설에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Watchmaker’s forceps #5 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4905 | 2 pairs required |
| Collagenase A | Roche Group | 10 103 578 001 | Wear mask |
| Porcine Pancreatin | Sigma-Aldrich | P8096 | Wear mask |
| DPBS w/ Ca, Mg | Lonza Inc. | 17-513F | With Mg & Ca |
| Fetal bovine serum (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | |
| KSFM | GIBCO, by Life Technologies | 10724-011 | without added growth factors |
| L-Glutamine 200mM | Sigma-Aldrich | G7513 | Use @ 1% v/v |
| PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml | Sigma-Aldrich | P4333 | Use @ 1% v/v |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | Supplied as powder |
| 24 well culture plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | Nunclon |
| DPBS w/o Mg & Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
| 5mL polystyrene tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| DNase (1 U/μl) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μl per 1.5 ml |
| 40 micron cell-strainer | BD Biosciences | 352235 | w/cap and tube |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Use @ 4 % w/v |
| Triton X100 | VWR international | VW3929-2 | Use @ 0.3 % v/v |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | Supplied as powder |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | Use @ 5 % v/v |
| Rabbit anti-PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | Dilute 1:100 |
| Rabbit anti-β-gal | MP Biomedicals | 559762 | Dilute 1:200 |
| Oregon Green 488 phalloidin | Invitrogen | O7466 | Dilute 1:200 |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute 1:200 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Dilute 1:5000 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Glycerol | EMD Millipore | GX0185-6 | Mix 50 % with H2O |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Use "DNase on column" protocol |
| Transfer pipettes, 3ml | BD Biosciences | 357575 |
References
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