הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial

Summary

מאמר זה מתאר השתלת רקמות טכניקה שנועדה לבדוק את איתות ותכונות של דפוסים האאקטודרם משטח cephalic במהלך הפיתוח craniofacial.

Abstract

הנגישות של עוברי העופות סייע embryologists ניסיוני להבין את גורלם של תאים במהלך ההתפתחות ואת תפקידו של אינטראקציות רקמות המווסתים דפוסים המורפוגנזה של בעלי חוליות (לדוגמה: ^{1, 2, 3, 4).} כאן, אנו ממחישים שיטה זו מנצלת את הנגישות כדי לבדוק את איתות ותכונות דפוסים של רקמות ectodermal במהלך התפתחות הפנים. בניסויים אלו, אנו יוצרים שליו, חומוס ⁵ או עכבר חומוס ⁶ מפלצות ידי השתלת האאקטודרם משטח cephalic המכסה את הלסת העליונה של שליו או בעכבר על אזור או באותו אזור או מחוץ לרחם של עוברים חומוס. השימוש שליו כמו רקמות התורם להשתלה לתוך אפרוחים פותחה על מנת לנצל את הסמן nucleolar נוכח שליו אך לא תאים חומוס, ובכך מאפשר לחוקרים להבחין מארח ורקמות תורם ^7. בדומה לכך, מרכיב חוזרות נמצא גנום העכבר, והוא הביע בכל מקום בגוף, אשר מאפשר לנו להבחין המארח רקמות התורם אפרוח ועכבר מפלצות ^8. השימוש האאקטודרם עכבר כמו רקמות התורם יהיה מאוד להרחיב את ההבנה שלנו של האינטראקציות הללו רקמות, כי זה יאפשר לנו לבחון את המאפיינים של איתות האאקטודרם שמקורם בעוברים מוטנטיים שונים.

Protocol

1. הכנת רקמות התורם

1. הכן התקשורת לתרבות, לחדד סיכות זכוכית, לחדד מחטים טונגסטן.
2. איסוף העובר מן המעטפת, להתרחץ קר כקרח PBS.
   1. בעזרת מזרק 10 מ"ל ו - 18 מחט מד להסיר 1.0 מ"ל של אלבומין מהקצה המחודד של מעטפת הביצית.
   2. עושים חור קטן בחלק העליון של הקליפה באמצעות נקודת מספריים, ולאחר מכן לחתוך פתח עגול לחשוף את העובר
3. הסר את הראש אל המקום DMEM (נסיוב בחינם, בטמפרטורת החדר)
4. לנתח תהליכים Frontonasal מעובר (או לאתר תורם אחרים, כגון תהליך לסתי או mandibular)
5. תקציר ב 2.4U / mL dispase ב PBS על הקרח עבור 20mins
6. כיסוי רקמות עם DMEM עם BSA 1% כדי לעצור העיכול
7. שימוש במחט טונגסטן חידד את האאקטודרם mesenchyme נפרד, ו neuroectoderm
8. חנות רקמת שתל ב BSA DMEM 1% על הקרח עד מארח מוכן להשתלה

2. הכנת מארח

1. לחשוף את העובר
   1. בעזרת מזרק 10 מ"ל ו - 18 מחט מד להסיר 1.0 מ"ל של אלבומין מהקצה המחודד של מעטפת הביצית.
   2. עושים חור קטן בחלק העליון של הקליפה באמצעות נקודת מספריים. מניחים נייר דבק על החור, ולאחר מכן לחתוך פתח עגול לחשוף את העובר.
2. שימוש 2 זוגות מלקחיים, לתפוס את amnion בעדינות דמעה לעשות חור.
3. סובב את ראשו על ידי הנחת זוג מלקחיים על עין ימין ועל הפעלת לחץ. בעוד מחזיק את הראש יציב, להשתמש במחט טונגסטן להסיר את האאקטודרם לארח כדי להתאים את השתל.
4. מעבירים את השתל לארח בעזרת פיפטה מזכוכית.
5. מיקום השתל להחליף את האאקטודרם הוסרו. הכנס סיכה זכוכית בכל פינה של הרקמה מורכבים להצמיד את השתל במקום. כדי להפוך את סיכות זכוכית, למשוך צינור microcapillary לנקודה קנס על אש אלכוהול.
6. מקום קלטת בחוזקה מעל החור ולהחזיר העובר אל האינקובטור לאורך זמן מתאים לניתוח.
7. ראה גם: ⁹

3. נציג תוצאות:

כדי להעריך מפלצות, עוברים יש לאסוף ולעבד לניתוח ההתפלגות של המארח רקמות התורם. עבור זיהוי של תאים שליו, אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן QcPN (המתואר: ³⁾ הוא מועסק, וכן עבור זיהוי של תאים בעכבר, ב הכלאה באתרו על סעיפים פרפין משמש ^6. תאים התורם צריך להיות מוגבל האפיתל, ולא צריך להיות שום עדות של רקמות התורם mesenchymal (איור 1). נוכחות של תאים מתורם בודד mesenchyme מצביע על נוכחות של תאים עצביים לפסגה זיהום אשר לבלבל כל פרשנות מורפולוגיים בשל השפעתם של תאים אלה על היבטים רבים של פיתוח פנים (למשל, ^10). לאחר משוכנע כי הטכניקה שתל ללא זיהום mesenchyme, מדדי התוצאה מורפולוגי נוסף או מולקולרית ניתן להשתמש כדי להעריך את מפלצות. לענייננו, זיהינו את נוכחותו של סחוסים ועצמות מחוץ לרחם כי תאמו כפילויות של הלסת העליונה שהיו המושרה על ידי רקמות להשתלה (איור 2), ואת השינויים המולקולריים ברקמות mesenchymal בתגובה האאקטודרם מורכבים (איור 3) ^5,6.

באיור 1. הערכת chimerism (א) נגד QcPN מכתים משמש כדי לזהות תאים שלווים שלווים, חומוס מפלצות. אין ראיות של מכתים ב mesenchyme. (ב) הכלאה באתרו משמש כדי לזהות את הביטוי של תעתיקים B2 סינוס ב עכבר חומוס מפלצות. הביטוי מוגבל האאקטודרם המרכיבים את השתל.

איור 2. מכתים Trichrome מראה שכפול של השלד הלסת העליונה הכימרה (א) שליו, חומוס, ו (ב) עכבר חומוס מפלצות.

איור 3. האאקטודרם regultes ביטוי גנים mesenchyme. (א) הביטוי רגיל Bmp7 ב mesenchyme של עובר אפרוח (רדיואקטיביים הכלאה באתרו עם אדום אות חיובי פסאודו בצבע ב Adobe Photoshop). (ב) הוא ביטוי Bmp7 המושרה mesenchyme הסמוך השתל (חץ) בעוברים chimeric.

Discussion

באמצעות שיטה זו השתלת אפשרה לנו לקבוע כי האאקטודרם מכיל מידע איתות המווסת את הקוטביות dorsoventral והסיומת proximodistal של הלסת העליונה. הדמיון של תוצאות בעת שימוש שליו או האאקטודרם העכבר השימור של אותות מולקולריים ברקמה זו בקרב מינים רבים ^6,11 מציין כי מדובר במרכז איתות שמור ביותר בקרב בעלי החוליות. יתר על כן, חוקרים אחרים השתמשו בטכניקות דומות כדי לבדוק את המאפיינים של איתות באזורים שונים של פני השטח האאקטודרם cephalic ו חשפו את נוכחותו של מרכזי איתות מרובים הממוקמים האאקטודרם שתורמים המורפוגנזה הפנים ^12. שיטה זו מאפשרת לנו להמשיך את הבנתנו את התפקיד רקמות שונות, כמו גם הבדלים אזוריים בתוך רקמות, לשחק במהלך התפתחות הפנים. לבסוף, על ידי שילוב העוצמה של העכבר הגנטיקה עם כוח של מערכת העופות, הכימרה נוכל להבהיר את המתווכים מולקולרית של אפיתל-mesenchymal אינטראקציות במהלך פיתוח, נוכל לזהות את המנגנונים שבאמצעותם אינטראקציות אלה מווסתים הפיתוח.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Tektronix, Inc.	TEKZR114
DMEM	University of California - San Francisco	CCFDA003
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Dispase	GIBCO, by Life Technologies	17105-041
35x10 mm Petri dish	Falcon BD	1008
No. 5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Spring Scissors	Fine Science Tools	15010-11
Needle holder	Fine Science Tools	26016-12
Tungsten Needle	Fine Science Tools	26000
Microcapillary tube	Drummond Scientific	3-000-225-G
Pasteur Pipets	Fisher Scientific	13-678-6B
Spring scissors	Fine Science Tools	15010-11
Blade holder	Fine Science Tools	10052-11
Razor blade	Fine Science Tools	10050-00