Summary
이 문서는 craniofacial 개발 중에 신호 및 표면 두부 ectoderm의 patterning 속성을 테스트하도록 설계되었습니다 조직 이식 기술을 설명합니다.
Abstract
조류 배아의 접근 실험 embryologists 개발 및 patterning과 척추 동물 morphogenesis (예, 1, 2, 3, 4) 규제 조직 상호 작용의 역할 동안 세포의 운명을 알고있었습니다. 여기, 우리는 얼굴 개발 중에 ectodermal 조직의 신호와 patterning 속성을 테스트하기 위해이 접근을 악용하는 방법을 설명합니다. 이 실험에서, 우리는 동일한 지역이나 여자는 태아의 이소성 지역 중 하나에 퀘일 드나 마우스에서 위턱을 커버 표면 두부 ectoderm를 이식하여 퀘일 - 여자 5 마우스 여자 6 chimeras를 만듭니다. 새끼로 이식을위한 기증자의 조직으로 메추라기의 사용은 그러므로 수사관은 호스트와 기증자의 조직 7 구별할 수 있도록, 메추라기에 존재하지만 여자는 세포 nucleolar 마커를 활용하기 위해 개발되었습니다. 우리는 마우스 여자 chimeras 8 호스트와 기증자의 조직을 구분 수있는, 마찬가지로 반복적인 요소는 마우스 게놈에 존재하고 ubiquitously 표시됩니다. 이 회사는 다양한 돌연변이 배아에서 파생 ectoderm의 신호 특성을 테스트할 수 있도록하기 때문에 기증자의 조직으로 마우스 ectoderm의 사용은 크게 다음과 조직 상호 작용에 대한 우리의 이해를 확장합니다.
Protocol
1. 기증자 조직을 준비
- , 문화, 미디어를 준비 유리 핀을 선명하게, 텅스텐 바늘을 날카롭게.
- 셸에서 배아를 수집, 얼음처럼 차가운 PBS로 세척.
- 10 ML의 주사기와 18 게이지 바늘을 사용하면 알 껍질의 지적 끝에서 알부민 1.0 ML를 제거합니다.
- 가위의 지점을 사용하여 쉘의 상단에 작은 구멍을 확인한 다음 배아를 노출하는 원형 여는 잘라
- DMEM (혈청 무료, 실온)에 머리와 장소를 제거
- 배아 (또는 상악 또는 mandibular 프로세스로 다른 기증자 사이트)에서 Frontonasal 프로세스를 해부하다
- 20mins를위한 얼음 PBS에 2.4U / ML dispase에 다이제스트
- 소화를 중지 1 % BSA와 DMEM과 조직을 커버
- 별도의 ectoderm, mesenchyme, 그리고 neuroectoderm에 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용하여
- 호스트가 이식을위한 준비가 될 때까지 얼음 DMEM 1 % BSA의 이식 조직을 저장
2. 호스트 준비
- 배아를 폭로
- 10 ML의 주사기와 18 게이지 바늘을 사용하면 알 껍질의 지적 끝에서 알부민 1.0 ML를 제거합니다.
- 가위의 지점을 사용하여 쉘의 상단에 작은 구멍을 만듭니다. 구멍을 통해 테이프의 조각을 장소, 그리고 배아를 노출하는 원형 여는 잘라.
- 포셉의 이쌍 사용하여 양막을 파악하고 부드럽게 구멍을 만들기 위해 찢어.
- 오른쪽 눈에 포셉 한 켤레를 삽입하고 압력을 적용하여 머리를 회전합니다. 머리가 안정적으로 유지되고 있지만, 이식을 수용하기 위해 호스트 ectoderm를 제거하는 텅스텐 바늘을 사용합니다.
- 유리 피펫을 사용하여 호스트에 그래프트를 전송합니다.
- 삭제 ectoderm을 대체할 그래프트를 놓습니다. 장소에 그래프트를 핀에 이식할 조직의 각 모서리에 유리 핀을 넣습니다. 유리 핀을하려면, 알코올 불꽃을 통해 좋은 지점으로 microcapillary 튜브를 당기십시오.
- 구멍을 통해 테이프를 단단히 장소 및 분석 시간의 적절한 기간 동안 인큐베이터에 배아를 반환합니다.
- 참고 : 9
3. 대표 결과 :
chimeras을 평가하기 위해, 배아가 수집 및 호스트와 기증자의 조직의 분배 분석을 위해 처리되어야합니다. QcPN 항체를 사용하여 메추라기 세포, immunohistochemistry의 감지 (에 설명된 : 3)를 고용하고, 파라핀 섹션에 원위치 하이브리드화의 마우스 세포의 검출을위한 6 사용됩니다. 기증자 세포는 상피로 제한되어야하고, 기증자 mesenchymal 조직의 증거 (그림 1)가 없어야합니다. mesenchyme에서 분리된 기증자 세포의 존재는 안면 발달의 여러 측면 (예, 10) 이러한 세포의 영향으로 인한 형태학의 해석을 혼란시킬 것입니다 오염 신경 능선 세포의 존재를 나타냅니다. 일단 이식 기법 mesenchyme 오염은 무료입니다 확신, 더 형태학의 또는 분자 결과 조치는 chimeras을 파악하기 위해 사용될 수 있습니다. 우리 목적을 위해서도, 우리는 (그림 3) 이식할 ectoderm에 대한 응답으로 이식 조직 (그림 2)와 mesenchymal 조직의 분자 변화에 의해 유발되었던 위턱의 duplications에 통신을 이소성 연골과 뼈의 존재를 감지 5,6.
그림 1. chimerism 평가 (A) 안티 QcPN 얼룩이 퀘일 - 여자는 chimeras에 메추라기 세포를 감지하는 데 사용됩니다. mesenchyme에 얼룩 흔적이 없다. (B) 현장 하이브리드화에서이 마우스 여자는 chimeras에 사인 B2의 성적 표현을 감지하는 데 사용됩니다. 표현은 그래프트로 구성된 ectoderm로 제한됩니다.
그림 2. Trichrome 얼룩은 (A) 퀘일 - 여자는 키메라의 위턱 해골의 복제, 그리고 (B) 마우스 여자의 chimeras를 보여줍니다.
그림 3. ectoderm은 mesenchyme에서 유전자 표현을 regultes. 여자는 배아의 mesenchyme에서 (A) 일반 Bmp7 표현 (어도비 포토샵에 긍정적인 신호 의사 붉은 색과 현장 하이브리드화에 방사능). (B) Bmp7 표현은 키메라 배아의 이식 (화살표)에 인접한 mesenchyme에서 유도됩니다.
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Discussion
이 이식 방법을 사용하면 우리가 ectoderm가 dorsoventral 극성과 위턱의 proximodistal 확장을 조절 신호 정보가 포함되어 확인할 수있었습니다. 메추라기 또는 마우스 ectoderm, 많은 종의 6,11 중에서이 조직의 분자 신호 보존을 사용하여 결과의 유사성이 척추 동물 중에서 고도로 보존되어 신호 중심을 나타냅니다. 또한, 다른 조사는 표면 두부 ectoderm 다양한 영역의 신호 특성을 테스트하기 위해 유사한 기술을 사용하고 얼굴 12 morphogenesis에 기여 ectoderm에있는 여러 개의 신호 센터의 존재를 발견했습니다. 이 방법은 우리가 다른 조직뿐 아니라 조직 내에서 지역 차이, 얼굴 개발하는 동안 재생하는 역할을 우리의 이해를 더 할 수 있습니다. 마지막으로, 조류 - 키메라 시스템의 강도와 마우스 유전자의 강도를 결합하여 우리는 개발하는 동안 상피 - mesenchymal 상호 작용의 분자 중재자를 명료하게하다 수있을 것입니다, 우리는 이러한 상호 작용은 조절하는 메커니즘을 확인하실 수 있습니다 개발.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 R01 - R01 - DE018234 및 DE019638에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Tektronix, Inc. | TEKZR114 | |
| DMEM | University of California - San Francisco | CCFDA003 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| 35x10 mm Petri dish | Falcon BD | 1008 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 | |
| Microcapillary tube | Drummond Scientific | 3-000-225-G | |
| Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Blade holder | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Razor blade | Fine Science Tools | 10050-00 |
References
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