Isolement murin îlots pancréatiques

Summary

Protocol

Préparation de la collagénase

1. Peser la collagénase dans une mémoire tampon de 50 ml et ajouter l'isolement coniques pour rendre la concentration finale, comme indiqué dans le tableau ci-dessous. Dissoudre la collagénase par vortex.
   
   
   (12 + 2 souris souris extra = 14 souris x 5 ml / souris = 70 ml de solution de collagénase total)
   
   
   (70 ml x 0,5 mg / ml ou 0,3 mg / ml = 35 mg ou 21 mg de collagénase P total)
   
   
   

   Souche	Âge	Collagénase P (mg / ml)	Temps (min)
   C3H, Balb / C, B6	> 12 semaines	0.8	17
   C3H, Balb / C, B6	<= 12 semaines	0.5	13
   NOD, NI NON	> 12 semaines	0.8	17
   NOD, NI NON	<= 12 semaines	0.5	17

   
   
   
2. Distribuer 2 ml de solution de collagénase dans chaque flacon de verre et le placer sur la glace. Charge à chaque seringue de 5 ml avec 3 ml d'aiguille 30g collagénase ajouter et placer dans la glace (préparer au capot).

Distension

1. Juste avant la dissection, le sacrifice des animaux par dislocation cervicale. Vaporiser l'ensemble du corps avec 70% d'EtOH, ce qui rend complètement mouillée. Faire un V-Insision à partir de la zone génitale. Tourner la souris de manière à la queue est face à vous.
2. Enlever l'intestin vers le côté gauche de la souris ouverte. Cela permettra d'exposer le pancréas et le canal cholédoque.
3. Placez une pince hémostatique de chaque côté de l'intestin grêle, où la voie biliaire draine, en laissant une petite poche pour solution de collagénase pour entrer dans l'intestin.
4. Gonflez le pancréas grâce à la voie biliaire avec une aiguille 30G et seringue de 5 ml contenant 3 ml de solution de collagénase froid, à partir de la vésicule biliaire.
5. Retirez le pancréas du corps et de le placer dans une fiole contenant siliconé 2 ml de solution de collagénase. Cette étape doit être fait rapidement et le plus proprement possible, en minimisant la collecte de tissus adipeux et conjonctifs.
6. Placer le flacon sur la glace et répétez l'étape 3 avec la souris suivante.

La digestion

1. Sceau chaque flacon et le placer dans un 37 ° C au bain-marie. Incuber pendant 13-17 minutes (le temps varie selon la souche et âge de l'animal).
2. Après le temps s'est écoulé, agiter vigoureusement le flacon. Le pancréas doit s'écrouler.
3. Verser chaque digérer dans une passoire évier stériles dans une grande stériles 1000 bécher et avec force la pipette hors de l'écran avec un tampon de lavage. Répartir le digère en tubes de 50 ml Coniques (3 pancreata/50 ml tube: si n = 12, utilisez suffisamment de tampon de lavage pour rendre le volume final de 200 ml et le distribuer aux tubes 4x50 ml). La dilution doit être fait rapidement et sur ​​la glace pour éviter la digestion îlot indésirables.
4. Isoler: Début de la centrifugeuse. Quand il atteint 1300 rpm, il s'éteint.
5. Aspirer le surnageant en laissant environ 5 mL. Soyez très prudent de ne pas aspirer le culot.
6. Resuspendre le culot en tapant vigoureusement avec votre main, puis ajouter 50 ml de tampon de lavage.
7. Isoler: Début de la centrifugeuse. Quand il atteint 1300 rpm, il s'éteint.
8. Reprendre le culot et laver avec 5 ml de tampon de lavage.
9. Transfert les 5 ml à 15 ml conique et spin bas, comme ci-dessus.
10. Aspirer le surnageant aussi complètement que possible. (Tampon restant pourrait causer le changement de la densité du Ficoll.)

Ficoll

Effectuer rapidement. Exposition à long terme de Ficoll est TOXIQUE pour les îlots.

1. Assurez-pastille est complètement rompu avant d'ajouter ficoll (tissu ininterrompue est difficile de remettre en suspension dans Ficoll).
2. Reprendre le culot dans 7 ml de Ficoll, densité 1,108, au vortex vigoureusement.
3. Couche sur le dessus de chaque densité de Ficoll 2ml de chacune des densités restent dans cet ordre: 1.096, 1.069, puis 1.037.
4. Spin pendant 15 minutes à 1800 rpm à 4 degrés, avec une pause OFF!
5. Choisissez îlots de la deuxième couche en utilisant spoid (stérile ppipette Lastic). Transférer toutes les collections à un coniques de 50 ml contenant environ 25 ml de tampon froid.
6. Lavez, comme ci-dessus, trois fois avec le tampon de lavage (répétant l'étape 12-15).
7. Ilots Remettre en suspension dans 20 ml de RPMI-1640 (contenant 10% de FCS et de la pénicilline et la streptomycine, HEPES, MEM-NEAA) et mélanger doucement. Retirer 100 ul d'échantillon pour le dénombrement.
8. Transférer 100 ul à 35 mm Grille-plaque contenant 1 ml de médias et une dithizone ml.
9. Incuber îlots restants dans RPMI 1640, dans un 37 ° C, 7% de CO ₂ incubateur, dans 160 plaques mm avec un total de 30 ml de milieu / plaque.
   
   

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Dithizone	reagent			Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed.
PBS	Buffer
HBSS	Buffer
Isolation soln.	Buffer			HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4
Wash soln.	Buffer			Isolation buffer containing 1mM CaCl2
Collagenase P		Boehringer Ingeheim	1213873
Dissection tools				Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue)
Syringe				sterile, 5ml, 1/mouse.
30 G needles				sterile, 1/syringe
siliconized glass vials w/Teflon cap		Fisher Scientific	213-018-54	sterile, 1/mouse
large sink strainer				sterile
1000 ml Beaker				sterile
Gauze pads				4x4, 2/mouse
plastic eye dropper				sterile
Mice	Animal