Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation

Summary

Protocol

Collagenase Vorbereitung

1. Abwiegen der Kollagenase in einen 50 ml konische und fügen Isolation Puffer, um die Endkonzentration, wie in der folgenden Tabelle angegeben zu machen. Lösen Sie die Kollagenase durch Vortexen.
   
   
   (12 Mäuse + 2 extra Mäuse = 14 Mäuse x 5 ml / Maus = 70 ml insgesamt Kollagenase-Lösung)
   
   
   (70 ml x 0,5 mg / ml oder 0,3 mg / ml = 35 mg oder 21 mg Kollagenase P gesamt)
   
   
   

   Belastung	Alter	Collagenase P (mg / ml)	Zeit (min)
   C3H, Balb / C, B6	> 12 Wochen	0,8	17
   C3H, Balb / C, B6	<= 12 Wochen	0,5	13
   NOD, NOR, NICHT	> 12 Wochen	0,8	17
   NOD, NOR, NICHT	<= 12 Wochen	0,5	17

   
   
   
2. Dispense 2 ml Kollagenase-Lösung in jede Glasflasche und auf Eis stellen. Legen Sie jeweils 5 ml Spritze mit 3 ml Kollagenase 30g Nadel und im Eis (Vorbereitung in der Kapuze).

Distension

1. Kurz vor Dissektion, opfern Tiere durch Genickbruch. Spray den ganzen Körper mit 70% EtOH, so dass es komplett nass. Machen Sie eine V-Insision ab dem Genitalbereich. Drehen Sie die Maus so den Schwanz weg von Ihnen zugewandt ist.
2. Entfernen Sie den Darm auf der linken Seite des offenen Maus. Dies legt die Bauchspeicheldrüse und Gallengang.
3. Legen Sie eine hemostat Klammer auf beiden Seiten der kleinen Darm, wo der Gallengang Kanalisation, so dass eine kleine Tasche für Kollagenase-Lösung in den Darm gelangen.
4. Inflate der Bauchspeicheldrüse durch den Gallengang mit einer 30g Nadel und 5 ml Spritze mit 3 ml kaltem Kollagenase-Lösung, beginnend an der Gallenblase.
5. Entfernen Sie die Bauchspeicheldrüse aus dem Körper und legen Sie sie in eine silikonisierte Fläschchen mit 2 ml Kollagenase-Lösung. Dieser Schritt sollte schnell und so sauber wie möglich durchgeführt werden, zu minimieren Ansammlung von Fett und Bindegewebe.
6. Legen Sie die Flasche auf Eis und wiederholen Sie Schritt 3 mit der nächsten Maus.

Verdauung

1. Seal jedes Fläschchen und legen Sie sie in ein 37 ° C Wasserbad. Inkubieren für 13-17 Minuten (variiert mit dem Stamm und Alter des Tieres).
2. Nach Zeit abgelaufen ist, schütteln kräftig. Die Bauchspeicheldrüse ist zerfallen.
3. Gießen Sie jedem Verdauungsvorgang durch eine große sterile Spülbeckensiebkopf in ein steriles 1000 ml Becherglas und Pipette mit Nachdruck aus dem Bildschirm mit Waschpuffer. Dispense die Sedimente in 50 ml konische Röhrchen (3 pancreata/50 ml Tube: wenn n = 12, verwenden Sie genug Waschpuffer auf das Endvolumen 200 ml zu machen und verzichten sie auf 4x50 ml Röhrchen). Die Verdünnung sollte schnell und auf Eis durchgeführt werden, um unerwünschte Insel Verdauung zu vermeiden.
4. Spin down: Start der Zentrifuge. Wenn es 1300 rpm erreicht, schalten Sie ihn aus.
5. Den Überstand aspirieren, so dass ca. 5 mL. Seien Sie sehr vorsichtig, nicht zu dem Pellet absaugen.
6. Pellet, indem Sie kräftig mit der Hand, dann mit 50 ml Waschpuffer.
7. Spin down: Start der Zentrifuge. Wenn es 1300 rpm erreicht, schalten Sie ihn aus.
8. Das Pellet und wäscht mit 5 ml Waschpuffer.
9. Übertragen Sie die 5 ml bis 15 ml konische und Spin-Down, wie oben beschrieben.
10. Saugen Sie den Überstand so vollständig wie möglich. (Remaining Puffer kann dazu führen, die Änderung der Dichte des Ficoll.)

Ficoll

Führen Sie schnell. Langfristige Ficoll Exposition ist giftig für kleine Inseln.

1. Stellen Sie sicher, Pellet vollständig ist vor der Zugabe von Ficoll (durchgezogene Gewebe ist schwierig, in Ficoll resuspendieren) gebrochen.
2. Das Pellet in 7 ml Ficoll, Dichte 1.108, durch Vortexen kräftig.
3. Layer übereinander Dichte von Ficoll 2ml jede der verbleibenden Dichten in dieser Reihenfolge: 1.096, 1.069, dann 1,037.
4. Spin für 15 Minuten bei 1800 rpm bei 4 Grad, mit Pause OFF!
5. Pick-Inseln aus der zweiten Schicht mit spoid (sterile plastic Pipette). Übertragen Sie alle Sammlungen auf einem 50 ml konischen mit ~ 25 ml kaltem Puffer.
6. Wash, wie oben, 3 mal mit Waschpuffer (Wiederholung von Schritt 12-15).
7. Resuspendieren Islets in 20 ml RPMI-1640 (mit 10% FCS und Penicillin und Streptomycin, HEPES, MEM-NEAA) und vorsichtig mischen. Nehmen Sie 100 ul der Probe für das Zählen.
8. Transfer 100 ul bis 35 mm Grid-Platte mit 1 ml Medium und 1 ml Dithizon.
9. Inkubieren übrigen Inseln in RPMI 1640, in einem 37 ° C, 7% CO _2-Inkubator, in 160 mm-Platten mit insgesamt 30 ml Medium / Platte.
   
   

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Dithizone	reagent			Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed.
PBS	Buffer
HBSS	Buffer
Isolation soln.	Buffer			HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4
Wash soln.	Buffer			Isolation buffer containing 1mM CaCl2
Collagenase P		Boehringer Ingeheim	1213873
Dissection tools				Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue)
Syringe				sterile, 5ml, 1/mouse.
30 G needles				sterile, 1/syringe
siliconized glass vials w/Teflon cap		Fisher Scientific	213-018-54	sterile, 1/mouse
large sink strainer				sterile
1000 ml Beaker				sterile
Gauze pads				4x4, 2/mouse
plastic eye dropper				sterile
Mice	Animal