Murine 췌장 아일릿 격리

Summary

Protocol

Collagenase 준비

1. 아래 표에 표시된 최종 농도를 만들기 위해 50 ML 원뿔 및 추가 절연 버퍼로 collagenase를 달다. vortexing하여 collagenase를 해산.
   
   
   (12 마우스 + 2 = 14 여분의 마우스 마우스 X 5 ML / 마우스 = 70 ML 총 collagenase 솔루션)
   
   
   (70 ML X 0.5 MG / ML 또는 collagenase P의 총 0.3 MG / ML = 35 MG 또는 21 MG)
   
   
   

   변형	나이	Collagenase P (MG / ML)	시간 (분)
   C3H, Balb / C, B6	> 12주	0.8	17
   C3H, Balb / C, B6	<= 12주	0.5	13
   NOD, NOR, 비	> 12주	0.8	17
   NOD, NOR, 비	<= 12주	0.5	17

   
   
   
2. 얼음 각 유리관과 장소에 collagenase 솔루션 2 ML 하는걸. collagenase 추가 30g 바늘과 얼음의 장소 (모자 준비) 3 ML 각 5 ML의 주사기를로드합니다.

팽만

1. 그냥 해부 전에 자궁 전위에 의해 동물을 희생. 완전히 서부 유럽 표준시 만드는 ETOH의 70 %로 전신을 스프레이. 성기 영역에서 시작 V - insision하십시오. 꼬리가 당신을 멀리 직면되도록 마우스를 회전합니다.
2. 열린 마우스의 왼쪽 변의를 제거합니다. 이것은 췌장과 일반적인 담즙 덕트를 노출합니다.
3. 대장를 입력 collagenase 솔루션을위한 작은 주머니를 떠나, 담즙 덕트가 빼낸 부분, 작은 창자의 양쪽에 hemostat 클램프를 놓습니다.
4. 담즙 방광에서 시작, 차가운 collagenase 솔루션 3 ML을 포함 30g 바늘 5 ML 주사기로 담즙 덕트를 통해 췌장을 급증.
5. 본문에서 췌장을 제거하고 collagenase 솔루션 2 ML을 포함 siliconized 약병에 놓으십시오. 이 단계는 지방과 결합 조직의 컬렉션을 최소화, 신속하고 같이 정상적으로 가능한 이루어져야합니다.
6. 다음 마우스로 얼음과 단계를 반복 3 병을 놓으십시오.

소화

1. 각 병을 밀봉하고 37 ° C 물 욕조에 넣습니다. 13-17분 (시간이 동물의 변형과 연령에 따라 다릅니다)을 품어.
2. 시간이 경과되면 적극적으로 병을 흔들. 췌장은 다투지한다.
3. 멸균 1000 ML의 비커에 큰 살균 싱크 스트레이너를 통해 각각의 다이제스트를 붓고하고 강제로 버퍼를 세척과 함께 화면을 피펫. 특면 50 ML conicals 튜브로 요약 (3 pancreata/50 ML 관 : 경우 N = 12 최종 볼륨 200 ML을 만들고 4x50 ML 튜브로 하는걸 버퍼를 충분히 세척 사용). 희석은 불필요한 아일릿 소화를 피하기 위해 빠르게 얼음에서 수행되어야합니다.
4. 스핀 다운 : 원심 분리기를 시작합니다. 그것이 1,300 rpm을 도달하면, 그것을 해제합니다.
5. ~ 5 ML을 떠나, 표면에 뜨는를 대기음. 펠렛을 대기음하지 매우주의하십시오.
6. Resuspend 펠렛은 손으로 적극적으로 도청에 의해, 다음 씻어 버퍼의 50 ML를 추가합니다.
7. 스핀 다운 : 원심 분리기를 시작합니다. 그것이 1,300 rpm을 도달하면, 그것을 해제합니다.
8. 세척 버퍼의 5 ML과 펠렛과 세척을 Resuspend.
9. 15 ML 원뿔에 5 ML을 전송하고 상기, 스핀 다운.
10. 가능한 완벽하게 뜨는을 대기음. (남은 버퍼 Ficoll의 밀도의 변화가 발생할 수 있습니다.)

Ficoll

신속하게 수행합니다. 장기 Ficoll 노출이 아일 레츠에 유해합니다.

1. 펠렛 완전히 ficoll을 (깨지지 조직 ficoll에 resuspend하기가 어렵습니다)을 추가하기 전에 헤어 졌 있는지 확인하십시오.
2. 적극적으로 vortexing으로 ficoll, 밀도 1.108, 7 ML에서 펠렛을 Resuspend.
3. 1.096, 1​​.069, 1.037 후이 순서에 남아있는 밀도 각각의 ficoll 2ml 각각의 밀도 위에 레이어.
4. OFF 휴식과 함께, 4도에서 1,800 rpm으로 15 분 동안 스핀!
5. spoid (멸균 P를 사용하여 두 번째 레이어에서 아일 레츠 선택lastic 스포이트). 감기 버퍼의 50 ML 원뿔 포함 ~ 25 ML 모든 컬렉션을 전송합니다.
6. 세척 버퍼 (12-15 단계를 반복)와, 상기 3 번 씻으십시오.
7. 에 Resuspend 아일 레츠 20 ML RPMI - 1640 (10 % FCS와 페니실린과 스트렙토 마이신, HEPES, 멤 - NEAA를 포함)와 부드럽게 섞는다. 계산에 대한 예제 100 UL을 제거합니다.
8. 미디어 1 ML의 dithizone 1 ML을 포함 35mm 그리드 - 판 100 UL을 전송합니다.
9. 미디어 / 판 30 ML의 총 160mm 접시에서 37 ° C, 7퍼센트 CO ₂ 배양기에서 RPMI 1640에 남아 아일 레츠를 품어.
   
   

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Dithizone	reagent			Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed.
PBS	Buffer
HBSS	Buffer
Isolation soln.	Buffer			HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4
Wash soln.	Buffer			Isolation buffer containing 1mM CaCl2
Collagenase P		Boehringer Ingeheim	1213873
Dissection tools				Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue)
Syringe				sterile, 5ml, 1/mouse.
30 G needles				sterile, 1/syringe
siliconized glass vials w/Teflon cap		Fisher Scientific	213-018-54	sterile, 1/mouse
large sink strainer				sterile
1000 ml Beaker				sterile
Gauze pads				4x4, 2/mouse
plastic eye dropper				sterile
Mice	Animal