Páncreas murino aislamiento Islet

Summary

Protocol

Preparación colagenasa

1. Pesar de la colagenasa en un búfer de 50 ml y agregar aislamiento cónico para que la concentración final, como se indica en la tabla de abajo. Disolver la colagenasa por agitación.
   
   
   (12 + 2 ratones ratones extra = 14 ratones x 5 ml / ratón = 70 ml de solución de colagenasa total)
   
   
   (70 ml x 0,5 mg / ml o 0,3 mg / ml = 35 mg o 21 mg de colagenasa total P)
   
   
   

   Tensión	Edad	Colagenasa P (mg / ml)	Tiempo (min)
   C3H, Balb / C, B6	> 12 semanas	0.8	17
   C3H, Balb / C, B6	<= 12 semanas	0.5	13
   NOD, NI, NO	> 12 semanas	0.8	17
   NOD, NI, NO	<= 12 semanas	0.5	17

   
   
   
2. Prescindir de 2 ml de solución de colagenasa en cada frasco de vidrio y el lugar en el hielo. Cargar cada jeringa de 5 ml con 3 ml de colagenasa añadir aguja 30G y el lugar en el hielo (preparación de campana).

Distensión

1. Justo antes de la disección, el sacrificio de animales por dislocación cervical. Rocíe todo el cuerpo con el 70% de EtOH, por lo que es completamente mojado. Hacer una V-Insision a partir de la zona genital. Gire el ratón por lo que la cola está de espaldas a usted.
2. Retira el intestino hacia el lado izquierdo del ratón abierto. Esto expondrá el páncreas y el conducto biliar común.
3. Coloque una pinza hemostática a ambos lados del intestino delgado, donde el conducto biliar desagües, dejando un pequeño espacio para la solución de colagenasa para entrar en el intestino.
4. Inflar el páncreas a través de la vía biliar con una aguja 30G y una jeringa de 5 ml que contiene 3 ml de solución de colagenasa frío, a partir de la vesícula biliar.
5. Extirpar el páncreas del cuerpo y colocarla en un frasco de silicona que contiene 2 ml de solución de colagenasa. Este paso se debe hacer más rápida y limpiamente como sea posible, reduciendo al mínimo la acumulación de tejido graso y conectivo.
6. Coloque el vial en el hielo y repita el paso 3 con el ratón al lado.

Digestión

1. Sellar cada vial y colóquelo en un 37 ° C en baño María. Incubar durante 13-17 minutos (el tiempo varía con la cepa y la edad del animal).
2. Después del tiempo transcurrido, agite el frasco vigorosamente. El páncreas debe deshacerse.
3. Vierta cada digestión a través de un tamiz estéril fregadero grande en un vaso de precipitados estéril 1000 y con fuerza la pipeta de la pantalla con tampón de lavado. Prescindir de los resúmenes, en tubos de 50 ml conicals (3 pancreata/50 tubo ml: si n = 12, el uso suficiente tampón de lavado para que el volumen final de 200 ml y dispensar a los tubos de 4x50 ml). La dilución debe hacerse con rapidez y en hielo para evitar la digestión islote no deseados.
4. Decantar: Inicio de la centrífuga. Cuando se llega a 1300 rpm, lo apaga.
5. Aspirar el sobrenadante, dejando ~ 5 ml. Tenga mucho cuidado de no aspirar el pellet.
6. Resuspender pellet golpeando con fuerza con la mano, a continuación, agregar 50 ml de tampón de lavado.
7. Decantar: Inicio de la centrífuga. Cuando se llega a 1300 rpm, lo apaga.
8. Resuspender el precipitado y lavar con 5 ml de tampón de lavado.
9. La transferencia de los 5 ml a 15 ml cónicos y girar hacia abajo, como arriba.
10. Aspirar el sobrenadante forma más completa posible. (Buffer restante puede hacer que el cambio de la densidad de la Ficoll.)

Ficoll

Realizar de forma rápida. La exposición prolongada Ficoll es tóxico para los islotes.

1. Asegúrese de pellet es completamente roto antes de añadir Ficoll (tejido intacto es difícil volver a suspender en Ficoll).
2. Resuspender el precipitado en 7 ml de Ficoll, la densidad de 1,108, por agitación vigorosa.
3. Capa en la parte superior de cada densidad de Ficoll 2 ml de cada una de las densidades que quedan en este orden: 1,096, 1,069, 1,037 continuación.
4. Girar durante 15 minutos a 1800 rpm a 4 grados, con una pausa de descuento!
5. Elige islotes de la segunda capa con spoid (estéril plastic cuentagotas). La transferencia de todas las colecciones a un cónico de 50 ml contiene aproximadamente 25 ml de tampón frío.
6. Lavado, como el anterior, 3 veces con tampón de lavado (repitiendo el paso 12-15).
7. Islotes Resuspender en 20 ml de RPMI-1640 (que contienen 10% de FCS y la penicilina y la estreptomicina, HEPES, MEM-AANE) y mezclar suavemente. Eliminar el 100 ul de la muestra para el recuento.
8. Transferencia de 100 ul a 35 mm rejilla de la placa que contiene 1 ml de los medios de comunicación y un ditizona ml.
9. Incubar islotes que quedan en RPMI 1640, en un 37 ° C, el 7% incubadora de CO _2, en 160 mm platos con un total de 30 ml de los medios de comunicación / placa.
   
   

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Dithizone	reagent			Dissolve 5mg Dithizone in 5 ml of DMSO in a 50 ml conical tube. Add 45 ml of normal saline and mix gently. Filter with a 60 cc syringe and a 0.22 "m syringe filter into a new 50 ml tube. Store at 4 OC, until use. Add 1 ml to each 35 mm counting Grid-plate, when needed.
PBS	Buffer
HBSS	Buffer
Isolation soln.	Buffer			HBSS containing 10 mM of HEPES, 1 mM of MgCl2, 5 mM of Glucose, pH 7.4
Wash soln.	Buffer			Isolation buffer containing 1mM CaCl2
Collagenase P		Boehringer Ingeheim	1213873
Dissection tools				Hemostat clamp (n=2), Forceps (n=2), Scissors (for skin incision an for taking out pancreas from adjacent tissue)
Syringe				sterile, 5ml, 1/mouse.
30 G needles				sterile, 1/syringe
siliconized glass vials w/Teflon cap		Fisher Scientific	213-018-54	sterile, 1/mouse
large sink strainer				sterile
1000 ml Beaker				sterile
Gauze pads				4x4, 2/mouse
plastic eye dropper				sterile
Mice	Animal