Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Эффективное полиэтиленгликоля (ПЭГ) Опосредованное Преобразование Мосс Physcomitrella patens Published: April 19, 2011 doi: 10.3791/2560
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute- WPI

Summary

Простой и эффективный метод для преобразования

Abstract

Простой и эффективный способ превратить Physcomitrella pantens протопластов описано. Этот метод адаптирован из протоколов для Physocmitrella protonemal протопласта и Arabidopsis трансформация протопластов мезофилла 1. Из-за его способности пройти эффективный митотической гомологичной рекомбинации, Physcomitrella patens стала важной модельной системой в последние годы 2. Эта способность позволяет высоких частот генов таргетинга 3-9, которые не видели в других растениях, таких как модель Arabidopsis. Чтобы воспользоваться всеми преимуществами этой системы, нам нужна эффективная и простой метод доставки ДНК в клетки мха. Наиболее распространенные способы, чтобы преобразовать эту мох бомбардировки частицами 10 и PEG-опосредованного поглощения ДНК 11. Хотя бомбардировки частицами может привести к высокой эффективности преобразования 12, ген пушки не доступны для многих лабораторий и протокол трудно стандартизировать. С другой стороны, ПЭГ опосредованной трансформации не требует специализированного оборудования, и может быть выполнена в любой лаборатории со стерильной капотом. Здесь мы покажем, простой и очень эффективный метод для трансформации протопластов мха. Этот метод может генерировать более 120 переходных трансформантов на микрограмм ДНК, что является улучшением по сравнению с наиболее эффективный протокол сообщалось ранее 13. Из-за своей простоты, эффективности и воспроизводимости, этот метод может быть применен к проектов, требующих большого числа трансформантов, а также для рутинных преобразований.

Protocol

1. Создание Протопласты

  1. Добавить 9 мл 8% маннита в чашке Петри.
  2. Используя лопаточку, поставить на 7 дней старый мох от 2-3 PPNH4 пластин 5 - в чашке Петри содержащие маннит.
  3. Добавьте 3 мл 2% Driselase (Sigma D9515-25G) на чашки Петри.
  4. Инкубировать чашки Петри при комнатной температуре с осторожном встряхивании в течение 1 часа.
  5. Фильтры протопластов суспензии через 100 мкм сетки (BD Сокол 352 350).
  6. Спиновые фильтруется подвески на 250 г в течение 5 минут. Удалить супернатант.
  7. Повторное приостановить протопластов очень нежно с 500 мкл 8% маннита.
  8. Добавить 9,5 мл 8% маннита в пробирку. Убедитесь, что протопласты полностью приостановлено.
  9. Повторите фильтрации и повторного взвешивания шагов (1.6, 1.7 и 1.8) еще два раза.
  10. Возьмите 10 мкл протопластов решения и считайте протопластов в гемоцитометра.
  11. Умножьте количество протопластов в 16 квадратных области, 10000, чтобы получить количество протопластов на мл (см. Рисунок 1).

2. Преобразование

  1. Спиновые протопластов подвески на 250 г в течение 5 минут. Удалить супернатант.
  2. Повторное приостановить протопластов в растворе ММГ при концентрации 1,6 млн. протопластов / мл.
  3. Инкубируйте протопластов суспензии при комнатной температуре в течение 20 минут.
  4. Добавить 600 мкл протопластов суспензии в пробирку, содержащие 60 мкг ДНК. Вихревые трубки мягко.
  5. Добавить 700 мкл PEG / Ca раствора в протопластов / ДНК смеси. Вихревые трубки мягко, пока вся смесь является однородной.
  6. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 30 минут.
  7. В течение этого периода ожидания, крышки ПРМ-Б пластин с целлофан (80 мм диаметр круга, А. А. Упаковка Limited, Великобритания); позволяют целлофан для увлажнения на поверхности пластины, по крайней мере 5 мин.
  8. С помощью шпателя, удалить пузырьки воздуха в ловушке между целлофан и пластины.
  9. Развести смесь с 3 мл W5 решение.
  10. Спиновые смеси на 250 г в течение 5 минут. Удалить супернатант.
  11. Повторное приостановить протопластов в топленом 2 мл PRM-T (перед добавлением к протопластов это решение может быть жидким при 42 ° С). Plate 1 мл повторно приостановить протопластов в ПРМ-Б пластина покрывается целлофан. Оберните пластин с микропоры (3M, здравоохранение). Держите пластин при 25 ° С в ростовой камере.
  12. Кроме того, протопластов может быть повторно приостановлено в 1 мл жидкой среды, покрытия и покрытия 0,5 мл на ПРМ-Б пластины, покрытой целлофаном. Это позволяет ускорить регенерацию, но количество растений регенерирующим ниже.
  13. Рост камере установлен на 16 час. свет и 8 часов. темно цикла.
  14. Перемещение целлофановых на на свежем пластины выбора через 4 дня после преобразования.

3. Представитель Результаты:

Пример преобразования показан на рисунке 2. ДНК используется в этом примере была суперспиральной 7,8 кб плазмиды проведения кассету гигромицину устойчивостью. Количество протопластов покрытием был сокращен до 50% на фотографии. Фотографии были сделаны через две недели после растения были перенесены на выбор пластин. Эффективность трансформации не зависит от концентрации ДНК до 60 мкг. Более высокие концентрации ДНК наносят ущерб эффективности преобразования. Данные показали, что этот метод обеспечивает последовательное результат в широком диапазоне ДНК количествах. Этот метод может также генерировать стабильные трансформанты эффективно, как показано в таблице 1, мы можем получить около 4 стабильные трансформанты на микрограмм линеаризованной ДНК, что значительно выше, чем сообщалось ранее 14.

Мы также проверили влияние теплового шока на эффективность трансформации путем преобразования суперспиральной плазмиды проведения ген флуоресцентного белка в качестве маркера. Теплового шока было проведено через 10 минут после комнате температуры инкубации (в пределах Шаг 2.6) путем инкубирования смеси в 45 ° С водяной бане в течение 3 минут. Смесь выдерживают на водяной бане комнатной температуры сразу после теплового шока в течение 17 мин. Результаты были записаны 22 часов после преобразования. Отношения трансформантов с и без теплового шока, были очень похожи (~ 25%), но мы наблюдали негативное влияние теплового шока на жизнеспособность протопластов (данные не приведены).

Рисунок 1
Рисунок 1. Посмотреть протопластов в гемоцитометра. Разделе необходимо для протопластов подсчета обозначается красным квадратом. Обратите внимание на 16 квадратов, необходимых для подсчета протопластов (см. 1.11), изображение показывает количество протопластов 24 (240 000 клеток / мл).

Рисунок 2
Рисунок 2. Картинки из 18 дневных переходных трансформантов. Протопласты были трансформируется с указанным количеством суперспиральной плазмиды. : 15μg; B: 30μg; C: 60μg; D: 120μg.

Количество ДНК (мкг) Эффективность (tranformants / мкг ДНК)
15, суперспиральной плазмиды 120 ± 24
30, суперспиральной плазмиды 145 ± 54
60, суперспиральной плазмиды 121 ± 60
120, суперспиральной плазмиды 71 ± 38
60, линеаризованной плазмиды 4 ± 1

Таблица 1. Преобразование эффективности в различных количествах ДНК.

Discussion

Метод позволяет представленные здесь просты и последовательны ДНК превращение в Physcomitrella протопластов patens. Этот метод был первоначально разработан для Arabidopsis 1, но здесь мы продемонстрировали, что он хорошо работает с протопластов Physcomitrella patens, проще и различные растения. Поэтому этот метод может быть применен к другим видам растений с незначительными изменениями. Возможные изменения для оптимизации включают протопластов концентрация в ММГ, время инкубации в растворе ММГ и PEG / Ca. Мы решили использовать 60 мкг ДНК в наших рутинных экспериментов, так как количество трансформантов линейно возрастает с концентрацией ДНК до этого момента (табл. 1). Мы могли бы получить примерно 7000 трансформантов переходных или 200 стабильных трансформантов на одном 60 мкг ДНК трансформации, что позволяет для дальнейшего обследования и анализа большого числа растений.

Преобразовано протопластов может быть либо распространяются с жидкой средой покрытие или PRM-T. Хотя эффективность регенерации ниже при жидкой среде покрытия используется, мы выбираем этот метод, когда протопластов были преобразованы с суперспиральной плазмид. Как показали в таблице 1, преобразования сделано с суперспиральной плазмидной ДНК генерировать много трансформантов и, таким образом, мы можем получить большое количество растений с жидкой средой обшивки. Кроме того, распространение протопластов с жидкой средой покрытие позволяет ускорить регенерацию, что очень важно для экспериментов с участием переходных фенотипов, таких как RNAi сбить экспериментов 9,15. Кроме того отсутствие верхней агар позволяет легко изоляции завод по иммунной и RT-PCR 9,15.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Л. В. поддерживается NSF (IOS 1002837)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PPNH4 1.84 mM KH2PO4
3.4 mM Ca(NO3)2
1 mM MgSO4
2.72 mM Diammonium tartrate
54 μM FeSO4.7H2O
9.93 μM H3BO3
1.97 μM MnCl2.4H2O
0.23 μM CoCl2.6H2O
0.19 μM ZnSO4. 7H2O
0.22 μM CuSO4. 5H2O
0.10 μM Na2MoO4.2H2O
0.168 μM KI
Add 0.7% agar for solid medium.
PRM-B PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates.
PRM-T PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use.
Liquid Plating Medium PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use.
2% Driselase Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use.
MMg 0.4 M mannitol
15 mM MgCl2
4 mM MES (pH 5.7)
PEG/Ca 4 g PEG4000
3 mL H2O
2.5 mL 0.8 M mannitol
1 mL 1M CaCl2
W5 154 mM NaCl
125 mM CaCl2
5 mM KCl
2 mM MES (pH 5.7)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abel, S., Theologis, T. Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression. Plant J. 5, 421-427 (1994).
  2. Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. Bryophytes as model systems. Bryologist. 103, 128-133 (2000).
  3. Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Plant J. 11, 1195-1206 (1997).
  4. Schaefer, D. G. Gene targeting in Physcomitrella patens. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).
  5. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).
  6. Cove, D. The moss Physcomitrella patens. Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).
  7. Kamisugi, Y. The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration. Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).
  8. Vidali, L. Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).
  9. Sawahel, W. Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun. Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).
  10. Schaefer, D. Stable transformation of the moss Physcomitrella patens. Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).
  11. Cho, S. H. Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens. Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).
  12. Ashton, N. W. The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements. New Phytol. 146, 391-402 (2000).
  13. Hohe, A. An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens. Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).
  14. Vidali, L. Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens. Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).

Tags

Биологии растений выпуск 50 преобразования Physcomitrella patens полиэтиленгликоль протопластов
Эффективное полиэтиленгликоля (ПЭГ) Опосредованное Преобразование Мосс<em> Physcomitrella patens</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Vidali, L. Efficient… More

Liu, Y., Vidali, L. Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens. J. Vis. Exp. (50), e2560, doi:10.3791/2560 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter