Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Effektiv polyetylenglykol (PEG) medierad Omvandling av Moss Muddermossa patens Published: April 19, 2011 doi: 10.3791/2560
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute- WPI

Summary

En enkel och effektiv metod att omvandla

Abstract

En enkel och effektiv metod att omvandla muddermossa pantens protoplasts beskrivs. Denna metod är anpassad från protokoll för Physocmitrella protonemal protoplastfusion och Arabidopsis mesophyll protoplastfusion omvandlingen 1. Tack vare sin förmåga att genomgå en effektiv mitotiska homolog rekombination, har muddermossa patens vuxit fram som ett viktigt modellsystem under de senaste åren 2. Denna förmåga gör att höga frekvenser av riktad genmodifiering 3-9, vilket inte syns i annan modell växter såsom Arabidopsis. För att dra full nytta av detta system behöver vi en effektiv och enkel metod för att leverera DNA i mossa celler. De vanligaste sätten att omvandla denna mossa är partikel bombardemang 10 och PEG-medierade DNA-upptag 11. Även partikel bombardemang kan producera en hög omvandlingseffektiviteten 12, gen vapen är inte lätt tillgänglig för många laboratorier och protokollet är svår att standardisera. Å andra sidan, kräver PEG medierad omvandling inte specialiserad utrustning, och kan utföras på alla laboratorier med en steril huva. Här visar vi en enkel och mycket effektiv metod för omvandling av mossa protoplasts. Denna metod kan generera mer än 120 övergående transformants per mikrogram av DNA, vilket är en förbättring från den mest effektiva protokollet tidigare rapporterade 13. På grund av sin enkelhet, effektivitet och reproducerbarhet, kan denna metod tillämpas på projekt som kräver stort antal transformants samt för rutinmässig omvandling.

Protocol

1. Göra Protoplasts

  1. Lägg till 9 ml på 8% mannitol till en petriskål.
  2. Med hjälp av en spatel, satte 7 dagar gammal mossa 2-3 PPNH4 plattor av 5 - i petriskålen innehåller mannitol.
  3. Tillsätt 3 ml 2% Driselase (Sigma D9515-25G) till petriskål.
  4. Inkubera petriskål vid rumstemperatur med försiktig skakning i 1 timme.
  5. Filtrera protoplastfusion fjädring genom en 100 ìm mesh (BD Falcon 352.350).
  6. Snurra filtreras fjädring på 250 g för 5 minuter. Avlägsna supernatanten.
  7. Återuppslamma protoplasts mycket försiktigt med 500 mikroliter 8% mannitol.
  8. Tillsätt 9,5 ml 8% mannitol i kulturen röret. Se protoplasts helt upphävas.
  9. Upprepa filtrering och resuspension steg (1,6, 1,7 och 1,8) två gånger till.
  10. Ta 10 mikroliter av protoplastfusion lösningen och räkna protoplasts i en hemocytometer.
  11. Multiplicera antalet protoplastfusion i en 16 kvadratmeter yta med 10.000 för att få antalet protoplasts per ml (se figur 1).

2. Omvandling

  1. Snurra protoplastfusion fjädring på 250 g för 5 minuter. Avlägsna supernatanten.
  2. Återsuspendera protoplasts i MMG lösning vid koncentrationen 1,6 miljoner protoplasts / ml.
  3. Inkubera protoplastfusion suspensionen vid rumstemperatur i 20 minuter.
  4. Tillsätt 600 mikroliter av protoplastfusion suspensionen i en kultur rör som innehåller 60 mikrogram DNA. Snurra röret försiktigt.
  5. Tillsätt 700 mikroliter av PEG / Ca lösningen i protoplastfusion / DNA-blandning. Snurra slangen försiktigt tills hela blandningen är homogen.
  6. Inkubera blandningen i rumstemperatur i 30 minuter.
  7. Under denna väntetid, täcka PRM-B plattor med cellofan (80 mm diameter cirklar, AA Packaging Limited, Storbritannien), låt cellofan för att återfukta på tallriken ytan i minst 5 minuter.
  8. Med en spatel, avlägsna eventuella luftbubblor fastnar mellan cellofan och plattan.
  9. Späd blandningen med 3 ml W5 lösning.
  10. Snurra på blandningen på 250 g för 5 minuter. Avlägsna supernatanten.
  11. Återsuspendera protoplasts i smält 2 mL PRM-T (innan den läggs till protoplasts denna lösning kan hållas flytande vid 42 ° C). Plate 1 mL återsuspendera protoplasts per PRM-B plåt som omfattas av cellofan. Linda plattor med Micropore (3M Hälsovård). Håll plattorna vid 25 ° C i en tillväxt kammare.
  12. Alternativt kan protoplasts åter skjutas i 1 ml vätska plätering medelstora och pläterade 0,5 ml på en PRM-B plåt täckt med cellofan. Detta möjliggör snabbare förnyelse, men antalet regenererande plantor är lägre.
  13. Tillväxten kammare är inställd på en 16 timmar. ljus och 8 tim. mörker-cykel.
  14. Flytta cellofan på att ett nytt urval tallrik 4 dagar efter omvandling.

3. Representativa resultat:

Ett exempel på omvandling visas i figur 2. De DNA används i detta exempel var en supercoiled 7,8 kb plasmid som bär en kassett hygromycin resistenta. Mängden pläterade protoplasts sänktes till 50% för fotografering. Bilderna togs två veckor efter växterna flyttades till val av plattorna. Omvandlingen effektivitet påverkas inte av DNA-koncentrationen till 60 mikrogram. Högre koncentrationer av DNA är till skada för effektiviteten i omvandlingen. Uppgifterna visade att denna metod ger jämna resultat över ett brett spektrum av DNA-mängder. Denna metod kan även generera stabila transformants effektivt som visas i tabell 1, vi kan få om fyra stabila transformants per mikrogram linjäriserade DNA, vilket är mycket högre än vad som tidigare rapporterats 14.

Vi testade även inverkan av värme chock på omvandlingseffektiviteten genom att förvandla en supercoiled plasmid bär en gen för ett fluorescerande protein som markör. Värmen chock genomfördes 10 minuter efter rumstemperatur inkubering (inom Steg 2,6) genom inkubering av blandningen i en 45 ° C vattenbad under 3 minuter. Blandningen var inkuberas i rumstemperatur vattenbad direkt efter värme chock för 17 min. Resultaten redovisades 22 timmar efter omvandling. Förhållandena för transformants erhållas med och utan värme chock var mycket lika (~ 25%), men vi observerade en negativ effekt av värme chock på livskraft protoplasts (data visas inte).

Figur 1
Figur 1. Vy över protoplasts i hemocytometer. Avsnittet som behövs för protoplastfusion räkna indikeras med en röd fyrkant. Notera den 16 rutor som behövs för att räkna protoplasts (se 1.11), bilden visar en sammanräkning av 24 protoplasts (240 tusen celler / ml).

Figur 2
Figur 2. Bilder på 18 dygn gamla övergående transformants. Protoplasts överfördesbildas med den angivna mängden supercoiled plasmid. A: 15μg, B: 30 mikrogram, C: 60μg, D: 120μg.

Mängd DNA (mikrogram) Effektivitet (tranformants / mikrogram DNA)
15, supercoiled plasmid 120 ± 24
30, supercoiled plasmid 145 ± 54
60, supercoiled plasmid 121 ± 60
120, supercoiled plasmid 71 ± 38
60, temperaturlinjär plasmid 4 ± 1

Tabell 1. Omvandlingseffektiviteten på olika DNA-mängder.

Discussion

Den metod som presenteras här ger en enkel och konsekvent DNA omvandling till muddermossa patens protoplasts. Metoden utvecklades ursprungligen för Arabidopsis 1, men här har vi visat att det fungerar bra med protoplasts av muddermossa patens, en enklare och annan anläggning. Därför kan denna metod tillämpas på andra arter med smärre modifieringar. Möjliga ändringar för optimering inkluderar protoplastfusion koncentration i MMG, inkubationstid på MMG och PEG / Ca lösning. Vi väljer att använda 60 mikrogram DNA i våra rutiner experiment eftersom antalet transformants ökar linjärt med DNA-koncentration till denna punkt (tabell 1). Vi skulle kunna få cirka 7000 övergående transformants eller 200 stabilt transformants på en enda 60 mikrogram DNA-omvandling, vilket möjliggör ytterligare screening och analys av en stor population av växter.

Den förvandlade protoplasts kan antingen spridas med flytande plätering medium eller PRM-T. Även om förnyelse effektivitet är lägre när vätskan plätering medium används, väljer vi den här metoden när protoplasts förvandlades med supercoiled plasmider. Som visade i tabell 1, transformationer görs med supercoiled plasmid-DNA generera många fler transformants och därmed kan vi fortfarande få ett stort antal anläggningar med flytande plätering medium. Dessutom sprider protoplasts med vätska plätering medelstora möjliggör snabbare förnyelse, vilket är viktigt för försök med övergående fenotyper, såsom RNAi riva experiment 9,15. Förutom avsaknad av övre agar möjliggör enkel anläggning isolering för immunfärgning och RT-PCR 9,15.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

LV stöds av NSF (IOS 1.002.837)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PPNH4 1.84 mM KH2PO4
3.4 mM Ca(NO3)2
1 mM MgSO4
2.72 mM Diammonium tartrate
54 μM FeSO4.7H2O
9.93 μM H3BO3
1.97 μM MnCl2.4H2O
0.23 μM CoCl2.6H2O
0.19 μM ZnSO4. 7H2O
0.22 μM CuSO4. 5H2O
0.10 μM Na2MoO4.2H2O
0.168 μM KI
Add 0.7% agar for solid medium.
PRM-B PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates.
PRM-T PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use.
Liquid Plating Medium PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use.
2% Driselase Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use.
MMg 0.4 M mannitol
15 mM MgCl2
4 mM MES (pH 5.7)
PEG/Ca 4 g PEG4000
3 mL H2O
2.5 mL 0.8 M mannitol
1 mL 1M CaCl2
W5 154 mM NaCl
125 mM CaCl2
5 mM KCl
2 mM MES (pH 5.7)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abel, S., Theologis, T. Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression. Plant J. 5, 421-427 (1994).
  2. Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. Bryophytes as model systems. Bryologist. 103, 128-133 (2000).
  3. Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Plant J. 11, 1195-1206 (1997).
  4. Schaefer, D. G. Gene targeting in Physcomitrella patens. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).
  5. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).
  6. Cove, D. The moss Physcomitrella patens. Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).
  7. Kamisugi, Y. The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration. Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).
  8. Vidali, L. Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).
  9. Sawahel, W. Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun. Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).
  10. Schaefer, D. Stable transformation of the moss Physcomitrella patens. Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).
  11. Cho, S. H. Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens. Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).
  12. Ashton, N. W. The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements. New Phytol. 146, 391-402 (2000).
  13. Hohe, A. An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens. Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).
  14. Vidali, L. Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens. Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).

Tags

Växtbiologi omvandling muddermossa patens polyetylenglykol protoplasts
Effektiv polyetylenglykol (PEG) medierad Omvandling av Moss<em> Muddermossa patens</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, Y., Vidali, L. Efficient… More

Liu, Y., Vidali, L. Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens. J. Vis. Exp. (50), e2560, doi:10.3791/2560 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter