Summary
Een eenvoudige en efficiënte methode te transformeren
Abstract
Protocol
1. Het maken van de Protoplasten
- Voeg 9 mL van 8% mannitol tot een petrischaal.
- Met behulp van een spatel, zet zeven dagen oud mos 2-3 PPNH4 platen van 5 - in de petrischaal met mannitol.
- Voeg 3 ml van 2% Driselase (Sigma D9515-25G) om de petrischaal.
- Incubeer de petrischaal bij kamertemperatuur onder zacht schudden gedurende 1 uur.
- Filter de protoplast suspensie door een 100 um mesh (BD Falcon 352.350).
- Spin het gefilterde suspensie bij 250 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de protoplasten heel voorzichtig met 500 pl van 8% mannitol.
- Voeg 9,5 ml 8% mannitol in de cultuur buis. Zorg ervoor dat protoplasten zijn volledig opgehangen.
- Herhaal de filtratie en de resuspensie stappen (1.6, 1.7 en 1.8) nog twee keer.
- Neem 10 pi van de protoplast oplossing en tel de protoplasten in een hemocytometer.
- Vermenigvuldig het aantal protoplast in een 16 vierkant gebied met 10.000 om het aantal protoplasten per ml (zie figuur 1).
2. Transformatie
- Spin de protoplast suspensie bij 250 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
- Re-schorten protoplasten in MMG oplossing bij de concentratie van 1,6 miljoen protoplasten / ml.
- Incubeer de protoplast suspensie bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Voeg 600 ul van protoplast suspensie in een cultuur buis met 60 pg DNA. Schud de buis voorzichtig.
- Voeg 700 ul van PEG / Ca-oplossing in de protoplast / DNA-mengsel. Schud de buis voorzichtig tot hele mengsel homogeen is.
- Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Tijdens deze wachttijd, cover PRM-B platen met cellofaan (80 mm diameter cirkels, AA Packaging Limited, Verenigd Koninkrijk), toestaan cellofaan te hydrateren op de plaat oppervlakte voor ten minste 5 minuten.
- Met een spatel, verwijder eventuele luchtbellen gevangen tussen het cellofaan en de plaat.
- Verdun het mengsel met 3 ml van de W5-oplossing.
- Draai het mengsel bij 250 g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant.
- Re-schorten protoplasten in gesmolten 2 ml van PRM-T (voordat u deze aan de protoplasten deze oplossing kan vloeistof worden bewaard bij 42 ° C). Plaat 1 mL van het opnieuw te schorten protoplasten per PRM-B plaat onder cellofaan. Wikkel de platen met Micropore (3M, Health Care). Houd de platen bij 25 ° C in een groeikamer.
- Als alternatief kan protoplasten opnieuw worden gesuspendeerd in 1 ml vloeistof plating medium en vergulde 0,5 ml op een PRM-B plaat bedekt met cellofaan. Hierdoor kan sneller herstel, maar het aantal regenereren planten lager is.
- Groeikamer is ingesteld voor een 16 uur. licht en 8 uur. donker cyclus.
- Verplaats het cellofaan op om een nieuwe selectie plaat 4 dagen na de transformatie.
3. Representatieve resultaten:
Een voorbeeld van transformatie is weergegeven in figuur 2. Het DNA in dit voorbeeld gebruikte was een helix 7,8 kb plasmide dat een hygromycine resistent cassette. De hoeveelheid plated protoplasten werd teruggebracht tot 50% voor de fotografie. De foto's werden genomen twee weken na het planten werden verplaatst naar de selectie platen. De transformatie-efficiëntie wordt niet beïnvloed door de DNA-concentratie tot 60 microgram. Hogere concentraties van DNA zijn nadelig voor de efficiëntie van de transformatie. De gegevens bleek dat deze methode consistent resultaat over een breed scala van DNA hoeveelheden levert. Deze methode kan ook leiden tot een stabiele transformanten effectief, zoals aangegeven in tabel 1, kunnen we ongeveer 4 stabiele transformanten per microgram van het gelineariseerde DNA, dat is veel hoger dan wat eerder werd gemeld 14.
We hebben ook het effect getest van heat shock op de transformatie-efficiëntie door het transformeren van een helix plasmide dat een gen voor een fluorescerend eiwit als marker. De heat shock werd uitgevoerd 10 minuten na kamertemperatuur incubatie (in stap 2.6) door het incuberen van het mengsel in een 45 ° C waterbad gedurende 3 minuten. Het mengsel werd geïncubeerd in een water op kamertemperatuur bad onmiddellijk na heat shock voor 17 minuten. De resultaten werden opgenomen 22 uur na de transformatie. De verhoudingen van de transformanten verkregen met en zonder heat shock waren zeer vergelijkbaar (~ 25%), maar zagen we een negatief effect van heat shock op de levensvatbaarheid van de protoplasten (gegevens niet getoond).
Figuur 1. Bekijk de protoplasten in hemocytometer. De afdeling die nodig is voor het tellen van protoplastfusie wordt aangegeven door een rood vierkant. Let op de 16 vierkantjes die nodig zijn voor het tellen van protoplasten (zie 1.11), de afbeelding toont een telling van 24 protoplasten (240.000 cellen / ml).
Figuur 2. Foto's van 18 dagen oud voorbijgaande transformanten. Protoplasten waren transgevormd met de aangegeven hoeveelheid van de dubbele helix plasmide. A: 15μg, B: 30μg, C: 60μg; D: 120μg.
| Hoeveelheid DNA (ug) | Efficiëntie (tranformants / ug DNA) |
| 15, supercoiled plasmide | 120 ± 24 |
| 30, supercoiled plasmide | 145 ± 54 |
| 60, supercoiled plasmide | 121 ± 60 |
| 120, supercoiled plasmide | 71 ± 38 |
| 60, gelineariseerde plasmide | 4 ± 1 |
Tabel 1. Transformatie efficiëntie op verschillende DNA bedragen.
Discussion
De methode hier gepresenteerde maakt een eenvoudige en consistente DNA transformatie in Physcomitrella patens protoplasten. Deze methode werd oorspronkelijk ontwikkeld voor Arabidopsis 1, maar hier hebben we aangetoond dat het goed presteert met protoplasten van Physcomitrella patens, een eenvoudiger en andere planten. Daarom kan deze methode worden toegepast op andere plantensoorten met kleine aanpassingen. Eventuele wijzigingen voor optimalisatie zijn protoplastfusie concentratie in MMG, incubatie tijd in MMG en PEG / Ca-oplossing. Kiezen we ervoor om 60 ug DNA gebruiken in onze routine experimenten, omdat het aantal transformanten lineair toeneemt met de DNA-concentratie tot dit punt (tabel 1). We konden krijgen ongeveer 7000 voorbijgaande transformanten of 200 stabiel transformanten op een enkel 60 ug DNA transformatie, die het mogelijk maakt voor verdere screening en analyse van een grote populatie van planten.
De getransformeerde protoplasten kan verspreiden met vloeibare plating medium of PRM-T worden. Hoewel de regeneratie rendement is lager als vloeibaar plating medium wordt gebruikt, kiezen we voor deze methode als de protoplasten werden getransformeerd met plasmiden dubbele helix. Zoals getoond in tabel 1, transformaties gedaan met helix plasmide DNA te genereren transformanten veel meer en dus kunnen we nog steeds grote aantallen van planten te verkrijgen met vloeibaar plating medium. Bovendien, het verspreiden van protoplasten met vloeibare plating medium kan er sneller herstel, wat belangrijk is voor experimenten met voorbijgaande fenotypes, zoals RNAi knock down experimenten 9,15. Naast de afwezigheid van de top agar zorgt voor makkelijke plant isolatie voor immunokleuring en RT-PCR 9,15.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
LV wordt ondersteund door de NSF (IOS 1002837)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
||
| PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. | ||
| PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. | ||
| Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. | ||
| 2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. | ||
| MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
||
| PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
||
| W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |
References
- Abel, S., Theologis, T. Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression. Plant J. 5, 421-427 (1994).
- Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. Bryophytes as model systems. Bryologist. 103, 128-133 (2000).
- Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Plant J. 11, 1195-1206 (1997).
- Schaefer, D. G. Gene targeting in Physcomitrella patens. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).
- Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).
- Cove, D. The moss Physcomitrella patens. Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).
- Kamisugi, Y. The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration. Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).
- Vidali, L. Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2009).
- Sawahel, W. Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun. Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).
- Schaefer, D. Stable transformation of the moss Physcomitrella patens. Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).
- Cho, S. H. Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens. Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).
- Ashton, N. W. The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements. New Phytol. 146, 391-402 (2000).
- Hohe, A. An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens. Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).
- Vidali, L. Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens. Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).
