Summary
変換するのは簡単かつ効率的な方法
Abstract
Protocol
1。プロトプラストの作成
- ペトリ皿にマンニトール8％9 mLを加え。
- スパチュラを用いて、5の2-3 PPNH4プレートから7日間の古い苔を置く - ペトリ皿を含むマンニトールで。
- シャーレに2％Driselase 3mLの（シグマD9515 - 25G）を追加します。
- 1時間静かに振とうしながら室温でペトリ皿をインキュベートする。
- 100μmのメッシュ（BDファルコン352350）を通じてプロトプラスト懸濁液をフィルターします。
- 5分の250 gでフィルタリングされたサスペンションを回転させる。上清を取り除く。
- 8％マンニトール500μLのと非常に穏やかにプロトプラストを再サスペンド。
- 培養チューブの9.5 mLの8％マンニトールを追加。プロトプラストが完全に中断されていることを確認します。
- ろ過と再懸濁のステップ（1.6、1.7および1.8）をさらに2回繰り返します。
- プロトプラスト溶液10μLを取り、血球計算盤でプロトプラストをカウント。
- mL当たりプロトプラストの数を取得するために、000で16㎡地域におけるプロトプラストの数を掛ける（図1を参照）。
2。変換
- 5分の250 gでプロトプラスト懸濁液をスピン。上清を取り除く。
- 160万プロトプラスト/ mLの濃度でMMGの溶液中でプロトプラストを再サスペンド。
- 20分間室温でプロトプラスト懸濁液をインキュベートする。
- 60μgのDNAを含有する培養管にプロトプラスト懸濁液600μLを加える。チューブ優しくスワール。
- プロトプラスト/ DNA混合物中にPEG / Caのソリューションを700μLを加える。全体の混合物が均質になるまでゆっくりと渦巻きがチューブ。
- 室温で30分間混合物をインキュベートする。
- 少なくとも5分間プレートの表面に水和物へのセロファンを可能にする、この待機期間中は、PRM - Bセロファン付きプレート（80 mm径の円、AAパッケージリミテッド、英国）をカバー。
- スパチュラで、セロファンとプレートの間に閉じ込められた気泡を取り除く。
- W5溶液3 mLの混合物を希釈する。
- 5分の250 gで混合物を回転させる。上清を取り除く。
- PRM - Tの溶融を2mLで再懸プロトプラスト（この溶液は42℃で液体に保つことができるプロトプラストに追加する前に）。セロハンでカバーPRM - Bプレート当たりの再サスペンドプロトプラストのプレート1 mLの。細孔（3M、ヘルスケア）でプレートを包みます。成長チャンバー内で25℃でプレートを保管してください。
- また、プロトプラストを液体メッキの培地とセロハンで覆われたPRM - Bプレート上にプレーティング0.5 mLを1 mLに再懸濁させることができる。これは速く再生することができますが、再生工場の数は低くなります。
- 成長チャンバーは16時間に設定されています。光と8時間。暗サイクル。
- 4日間の変換後の新鮮な選択プレートに上にセロハンを移動します。
3。代表的な結果：
変換の例を図2に示されています。この例で使用されているDNAは、ハイグロマイシン耐性カセットを有するプラスミドスーパーコイル7.8キロバイトでした。播種プロトプラストの量は、写真撮影のための50％に減少した。写真は、植物を選択プレートに移動された二週間後に採取された。形質転換効率は最大60μgまでのDNA濃度の影響を受けません。 DNAの高濃度では形質転換の効率に有害である。データは、このメソッドは、DNA量の広い範囲にわたって一貫性のある結果をもたらすことを示した。また、このメソッドは効果的に表1に示すように安定した形質転換体を生成することも可能です。こちらは、以前に14に報告されたものよりはるかに高い直鎖状DNAのマイクログラムあたり4安定した形質転換体を、約得ることができます。
我々はまた、マーカーとしての蛍光タンパク質の遺伝子を運ぶスーパーコイルプラスミドを形質転換して形質転換効率で熱ショックの効果を試験した。熱ショックは3分間45℃の水浴で混合物をインキュベートすることにより、10分室温でのインキュベーション（ステップ2.6以内）後に実施した。混合物を17分間熱ショック直後に室温の水浴中でインキュベートした。結果は、22時間変換後に記録した。で得られた形質転換体と熱ショックなしの比率は（〜25％）非常に類似していたが、我々は、プロトプラスト（データは示さず）の生存に熱ショックの悪影響を観察した。
図1。血球計算板のプロトプラストの表示。プロトプラストの計数のために必要なセクションが赤い四角で示されます。プロトプラストをカウントするために必要な16の正方形の点に注意してください（1.11参照）、画像は24プロトプラスト（240,000細胞/ mL）の数を示しています。
図2。 18日間の古い一時的な形質転換体の写真。プロトプラストのトランスいたスーパーコイル状プラスミドの指示された量で形成。 ：15μg、B：30μg、C：60μg、D：120μg。
| DNAの量（μg） | 効率（tranformants /μgのDNA） |
| 15は、プラスミドスーパーコイル | 120 ± 24 |
| 30は、プラスミドスーパーコイル | 145 ± 54 |
| 60は、プラスミドスーパーコイル | 121 ± 60 |
| 120は、プラスミドスーパーコイル | 71 ± 38 |
| 60は、線状化プラスミド | 4 ± 1 |
種々のDNA量で表1。形質転換効率。
Discussion
ここで紹介する方法は、 ヒメツリガネゴケのプロトプラストへの単純で一貫性DNA形質転換が可能になります。このメソッドはもともとシロイヌナズナ 1の開発が、ここではそれがヒメツリガネゴケ 、簡単で異なる植物のプロトプラストとよく実行することが実証された。したがって、この方法は若干変更して他の植物種に適用することができます。最適化のための実行可能な変更は、MMGとPEG /カルシウム溶液中でのMMGのプロトプラストの濃度、インキュベーション時間が含まれています。形質転換体の数がこの時点（表1）までのDNA濃度に比例して増加するため、我々は、ルーチンの実験で60μgのDNAを使用することを選択。我々は、植物の大規模な人口のさらなるスクリーニングと分析ができるように、単一の60μgのDNA形質転換、上の約7000の過渡形質転換体または200安定な形質転換体を得ることができる。
変換されたプロトプラストを液体メッキ媒体またはPRM - Tで拡散することができるのどちらか。再生効率が液体メッキの培地が使用されているときに低いですがプロトプラストをスーパーコイル状のプラスミドで形質転換されたとき、我々はこの方法を選択してください。表1に示した、スーパーコイルプラスミドDNAで行う変換は、より多くの形質転換体を生成し、したがって、我々はまだ液体メッキの培地で植物の多数を得ることができます。さらに、液体メッキ培地でプロトプラストを分散するとの実験9,15をノックダウンするようなRNAiのような一時的な表現型を、関連する実験のために重要である高速な再生を可能にする。さらに、トップアガーがない場合は、免疫染色とRT - PCR 9,15のための簡単な植物を分離することができます。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
LVは、NSF（IOS 1002837）によってサポートされています
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PPNH4 | 1.84 mM KH2PO4 3.4 mM Ca(NO3)2 1 mM MgSO4 2.72 mM Diammonium tartrate 54 μM FeSO4.7H2O 9.93 μM H3BO3 1.97 μM MnCl2.4H2O 0.23 μM CoCl2.6H2O 0.19 μM ZnSO4. 7H2O 0.22 μM CuSO4. 5H2O 0.10 μM Na2MoO4.2H2O 0.168 μM KI Add 0.7% agar for solid medium. |
||
| PRM-B | PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates. | ||
| PRM-T | PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. | ||
| Liquid Plating Medium | PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use. | ||
| 2% Driselase | Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use. | ||
| MMg | 0.4 M mannitol 15 mM MgCl2 4 mM MES (pH 5.7) |
||
| PEG/Ca | 4 g PEG4000 3 mL H2O 2.5 mL 0.8 M mannitol 1 mL 1M CaCl2 |
||
| W5 | 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH 5.7) |
References
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