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Biology

कुशल polyethylene glycol (खूंटी) मॉस की मध्यस्थता परिवर्तन Physcomitrella patens doi: 10.3791/2560 Published: April 19, 2011

Summary

एक सरल और कुशल पद्धति को बदलने

Abstract

Physcomitrella pantens protoplasts परिणत करने के लिए एक सरल और कुशल विधि वर्णित है. इस विधि Physocmitrella protonemal मूलतत्त्व और Arabidopsis mesophyll मूलतत्त्व एक परिवर्तन के लिए प्रोटोकॉल से अनुकूलित है. अपनी कुशल mitotic मुताबिक़ पुनर्संयोजन गुजरना क्षमता के कारण, Physcomitrella patens महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली के रूप में हाल ही में 2 वर्षों में उभरा है. इस क्षमता जीन की उच्च आवृत्तियों 3-9 लक्ष्यीकरण, जो Arabidopsis जैसे अन्य मॉडल पौधों में नहीं देखा है की अनुमति देता है. इस प्रणाली के पूर्ण लाभ लेने के लिए, हम एक प्रभावी और आसान विधि काई कोशिकाओं में डीएनए देने की जरूरत है. इस काई को बदलने के लिए सबसे आम तरीके कण 10 बमबारी और खूंटी की मध्यस्थता डीएनए तेज 11 कर रहे हैं. हालांकि कण बमबारी में एक उच्च परिवर्तन 12 दक्षता का उत्पादन कर सकते हैं, जीन बंदूकें आसानी से कई प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध नहीं हैं प्रोटोकॉल के मानकीकरण के लिए मुश्किल है. दूसरी ओर, खूंटी मध्यस्थता परिवर्तन विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं करता, और किसी भी प्रयोगशाला में एक बाँझ हुड के साथ किया जा सकता है है. यहाँ, हम काई protoplasts के परिवर्तन के लिए एक सरल और अत्यधिक कुशल तरीका दिखा. इस विधि डीएनए है, जो सबसे कुशल प्रोटोकॉल से एक सुधार है माइक्रोग्राम प्रति 120 से अधिक क्षणिक transformants उत्पन्न पहले से 13 की रिपोर्ट कर सकते हैं. अपनी सादगी, दक्षता, और reproducibility की वजह से, इस विधि transformants की बड़ी संख्या दिनचर्या परिवर्तन के लिए की आवश्यकता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परियोजनाओं के लिए लागू किया जा सकता है.

Protocol

1. Protoplasts बनाना

  1. 8% एक पेट्री डिश को mannitol 9 एमएल जोड़ें.
  2. पेट्री डिश युक्त mannitol में - एक रंग का प्रयोग, 2-3 के 5 PPNH4 प्लेटें से 7 दिन पुराने काई डाल दिया.
  3. पेट्री डिश में 2% की Driselase के 3 एमएल (सिग्मा D9515-25g) जोड़ें.
  4. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोमल झटकों के साथ पेट्री डिश सेते हैं.
  5. 100 सुक्ष्ममापी मेष (बी फाल्कन 352350) के माध्यम से मूलतत्त्व निलंबन फ़िल्टर.
  6. 5 मिनट के लिए 250 ग्राम पर फ़िल्टर निलंबन स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  7. Protoplasts 8% mannitol के 500 μL के साथ बहुत धीरे पुनः निलंबित.
  8. संस्कृति ट्यूब में 9.5 एमएल 8% mannitol जोड़ें. सुनिश्चित करें protoplasts पूरी तरह से निलंबित कर रहे हैं.
  9. छानने का काम और फिर निलंबन (1.6, 1.7 और 1.8) कदम दो बार दोहराएँ.
  10. आदर्श समाधान के 10 μL ले लो और एक hemocytometer में protoplasts गिनती.
  11. एमएल प्रति protoplasts की संख्या (चित्रा 1 देखें) प्राप्त 10,000 द्वारा एक 16 वर्ग क्षेत्र में आदर्श की संख्या गुणा.

2. परिवर्तन

  1. 5 मिनट के लिए 250 ग्राम पर मूलतत्त्व निलंबन स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  2. 1.6 मिलियन protoplasts / एमएल की एकाग्रता पर MMg समाधान में protoplasts पुन-निलंबित.
  3. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए मूलतत्त्व निलंबन सेते हैं.
  4. एक संस्कृति ट्यूब में 60 μg डीएनए युक्त मूलतत्त्व निलंबन के 600 μL जोड़ें. ट्यूब धीरे भंवर.
  5. मिश्रण / मूलतत्त्व डीएनए में खूंटी / Ca समाधान के 700 μL जोड़ें. भंवर ट्यूब धीरे जब तक पूरे मिश्रण सजातीय है.
  6. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मिश्रण को सेते हैं.
  7. यह प्रतीक्षा अवधि के दौरान, सिलोफ़न के साथ PRM-B प्लेटें (80 मिमी व्यास हलकों, ए.ए. पैकेजिंग लिमिटेड, ब्रिटेन) को कवर, कम से कम 5 मिनट के लिए थाली की सतह पर हाइड्रेट सिलोफ़न की अनुमति.
  8. एक रंग के साथ, किसी भी हवाई बुलबुले सिलोफ़न और प्लेट के बीच फंस हटा दें.
  9. W5 समाधान के 3 एमएल के साथ मिश्रण पतला.
  10. 5 मिनट के लिए 250 ग्राम मिश्रण स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  11. PRM-टी पिघला 2 एमएल में पुनः निलंबित protoplasts (यह protoplasts 42 ° C में इस समाधान तरल रखा जा सकता है जोड़ने से पहले). PRM-B सिलोफ़न द्वारा कवर की थाली के प्रति फिर से निलंबित protoplasts के 1 एमएल प्लेट. Micropore (3M, स्वास्थ्य देखभाल) के साथ प्लेटें लपेटें. 25 डिग्री सेल्सियस पर एक विकास कक्ष में प्लेटों का रखें.
  12. वैकल्पिक रूप से, protoplasts किया जा सकता है तरल चढ़ाना मध्यम और एक PRM-B सिलोफ़न के साथ कवर प्लेट पर चढ़ाया 0.5 एमएल के 1 एमएल में फिर से निलंबित कर दिया. यह तेजी से उत्थान की अनुमति देता है, लेकिन regenerating के पौधों की संख्या कम है.
  13. ग्रोथ चैम्बर एक 16 घंटे के लिए सेट कर दिया जाता है. प्रकाश और 8 घंटा. अंधेरे चक्र.
  14. 4 दिनों के परिवर्तन के बाद एक ताजा चयन थाली पर सिलोफ़न ले जाएँ.

3. प्रतिनिधि परिणाम:

परिवर्तन का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. इस उदाहरण में प्रयोग किया जाता डीएनए supercoiled 7.8 प्लाज्मिड केबी hygromycin प्रतिरोधी कैसेट ले गया था. मढ़वाया protoplasts की राशि फोटोग्राफी के लिए 50% कम हो गया था. तस्वीरें ले जाया गया दो सप्ताह के बाद पौधों चयन प्लेटों के लिए चले गए थे. परिवर्तन दक्षता 60 μg डीएनए एकाग्रता द्वारा प्रभावित नहीं है. डीएनए के उच्च सांद्रता परिवर्तन की दक्षता के लिए हानिकारक हैं. आंकड़ों से पता चला है कि इस विधि के डीएनए की मात्रा की एक विस्तृत श्रृंखला में लगातार परिणाम उद्धार. यह विधि भी स्थिर प्रभावी रूप से तालिका 1 में दिखाया transformants उत्पन्न कर सकते हैं, हम linearized डीएनए, जो जो 14 पहले से सूचना मिली थी की तुलना में ज्यादा है माइक्रोग्राम प्रति 4 स्थिर transformants के बारे में प्राप्त कर सकते हैं.

हम भी एक supercoiled एक मार्कर के रूप में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एक जीन ले जाने प्लाज्मिड बदलने के द्वारा परिवर्तन की क्षमता पर गर्मी के सदमे से प्रभाव का परीक्षण किया. गर्मी झटका बाहर किया गया था एक 3 मिनट के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मिश्रण incubating द्वारा कमरे के तापमान ऊष्मायन के बाद 10 मिनट (2.6 चरण के भीतर). मिश्रण एक कमरे के तापमान पानी से स्नान में incubated तुरंत बाद 17 मिनट के लिए गर्मी झटका. परिणाम परिवर्तन के 22 घंटे बाद दर्ज किया गया. के साथ प्राप्त transformants की और बिना गर्मी झटका अनुपात बहुत इसी तरह की (~ 25%) थे, लेकिन हम protoplasts (नहीं दिखाया डेटा है) की व्यवहार्यता पर गर्मी सदमे से एक प्रतिकूल प्रभाव मनाया.

चित्रा 1
चित्रा 1. Hemocytometer में protoplasts के मूलतत्त्व गिनती के लिए आवश्यक अनुभाग देखें एक लाल वर्ग ने संकेत दिया है . नोट protoplasts (1.11 देखें) की गिनती के लिए आवश्यक 16 चौकों, छवि 24 protoplasts (240,000 कोशिकाओं / एमएल) की गणना से पता चलता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. 18 दिन पुराने क्षणिक transformants के चित्र Protoplasts. ट्रांस थेsupercoiled प्लाज्मिड के संकेत राशि के साथ बनाई है. एक: 15μg, बी: 30μg, सी: 60μg, डी: 120μg.

डीएनए (μg) की राशि क्षमता (tranformants / μg डीएनए)
15, प्लाज्मिड supercoiled 120 ± 24
30, प्लाज्मिड supercoiled 145 ± 54
60, प्लाज्मिड supercoiled 121 ± 60
120, प्लाज्मिड supercoiled 71 ± 38
60, प्लाज्मिड linearized 4 ± 1

टेबल 1 विभिन्न डीएनए मात्रा में परिवर्तन दक्षता.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत विधि एक सरल और सुसंगत Physcomitrella patens protoplasts में डीएनए परिवर्तन के लिए सक्षम बनाता है. इस पद्धति का मूल एक Arabidopsis के लिए विकसित किया गया था, लेकिन हम यहाँ दिखा दिया है कि यह Physcomitrella patens, एक सरल और विभिन्न संयंत्र के protoplasts के साथ अच्छी तरह से करता है. इसलिए, इस विधि मामूली संशोधनों के साथ अन्य प्रजातियों के पौधे को लागू किया जा सकता है. अनुकूलन के लिए संभावित संशोधनों MMg MMg और / खूंटी Ca समाधान में ऊष्मायन समय में मूलतत्त्व एकाग्रता शामिल हैं. हम हमारी दिनचर्या प्रयोगों में 60 μg डीएनए का उपयोग करना चुनते हैं क्योंकि transformants की संख्या डीएनए एकाग्रता के साथ linearly इस बिंदु (1 टेबल) तक बढ़ जाती है. हम लगभग 7000 क्षणिक या एक एकल 60 μg डीएनए परिवर्तन, जो आगे और पौधों की एक बड़ी आबादी की स्क्रीनिंग के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है पर transformants 200 स्थिर transformants मिल सकता है.

तब्दील protoplasts तरल चढ़ाना मध्यम या PRM-टी के साथ या तो फैल सकता है. हालांकि उत्थान दक्षता जब तरल चढ़ाना मध्यम प्रयोग किया जाता है कम है, हम इस विधि का चयन जब protoplasts supercoiled plasmids के साथ बदल रहे थे. जैसा कि तालिका 1 में दिखाया है, supercoiled प्लास्मिड डीएनए के साथ किया परिवर्तनों कई और अधिक transformants उत्पन्न और इस प्रकार, हम अभी भी तरल चढ़ाना माध्यम के साथ पौधों की बड़ी संख्या प्राप्त कर सकते हैं. इसके अलावा, तरल चढ़ाना माध्यम से फैल protoplasts तेजी से उत्थान, जो आरएनएआई जैसे क्षणिक phenotypes, दस्तक नीचे 9,15 प्रयोगों से जुड़े प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है की अनुमति देता है. इसके अलावा शीर्ष अगर के अभाव immunostaining और RT-पीसीआर 9,15 के लिए आसान संयंत्र अलगाव के लिए अनुमति देता है .

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

एल.वी. NSF द्वारा समर्थित (1002837 IOS) है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PPNH4 1.84 mM KH2PO4
3.4 mM Ca(NO3)2
1 mM MgSO4
2.72 mM Diammonium tartrate
54 μM FeSO4.7H2O
9.93 μM H3BO3
1.97 μM MnCl2.4H2O
0.23 μM CoCl2.6H2O
0.19 μM ZnSO4. 7H2O
0.22 μM CuSO4. 5H2O
0.10 μM Na2MoO4.2H2O
0.168 μM KI
Add 0.7% agar for solid medium.
PRM-B PPNH4 with 6% mannitol and 0.8% agar. Add 10 mL 1M CaCl2 to 1 L before pouring plates.
PRM-T PPNH4 with 6% mannitol and 0.6% agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use.
Liquid Plating Medium PPNH4 with 8.5% mannitol without agar. Add 0.5 mL 1M CaCl2 to 50 mL before use.
2% Driselase Add 4 g of Driselase (Sigma D9515-25G) to 200 mL of 8% mannitol. Stir gently for 30 min. at room temperature, incubate 30 min. at 4°C, and stir gently for 5 min. at room temperature. Spin 2,500 g for 10 min, discard pellet. Filter with 0.22 μm, and store frozen as 10 mL aliquots. Thaw in a room temperature water bath before use.
MMg 0.4 M mannitol
15 mM MgCl2
4 mM MES (pH 5.7)
PEG/Ca 4 g PEG4000
3 mL H2O
2.5 mL 0.8 M mannitol
1 mL 1M CaCl2
W5 154 mM NaCl
125 mM CaCl2
5 mM KCl
2 mM MES (pH 5.7)

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References

  1. Abel, S., Theologis, T. Transient transformation of Arabidopsis leaf protoplasts: a versatile experimental system to study gene expression. Plant J. 5, 421-427 (1994).
  2. Wood, A. J., Oliver, M. J., Cove, D. J. Bryophytes as model systems. Bryologist. 103, 128-133 (2000).
  3. Schaefer, D. G., Zrÿd, J. -P. Efficient gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Plant J. 11, 1195-1206 (1997).
  4. Schaefer, D. G. Gene targeting in Physcomitrella patens. Curr. Opin. Plant Biol. 4, 143-150 (2001).
  5. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Res. 33, e173-e173 (2005).
  6. Cove, D. The moss Physcomitrella patens. Annu. Rev. Genet. 39, 339-358 (2005).
  7. Kamisugi, Y. The mechanism of gene targeting in Physcomitrella patens: homologous recombination, concatenation and multiple integration. Nucleic Acids Res. 34, 6205-6215 (2006).
  8. Vidali, L. Rapid formin-mediated actin-filament elongation is essential for polarized plant cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2009).
  9. Sawahel, W. Transfer of foreign DNA into Physcomitrella protonemal tissue by using the gene gun. Plant Mol. Biol. 10, 315-316 (1992).
  10. Schaefer, D. Stable transformation of the moss Physcomitrella patens. Mol. Gen. Genet. 226, 418-424 (1991).
  11. Cho, S. H. Particle bombardment mediated transformation and GFP expression in the moss Physcomitrella patens. Mol. Cells. 9, 14-19 (1999).
  12. Ashton, N. W. The bryophyte Physcomitrella patens replicates extrachromosomal transgenic elements. New Phytol. 146, 391-402 (2000).
  13. Hohe, A. An improved and highly standardized transformation procedure allows efficient production of single and multiple targeted gene-knockouts in a moss, Physcomitrella patens. Curr. Genet. 44, 339-347 (2004).
  14. Vidali, L. Profilin is essential for tip growth in the moss Physcomitrella patens. Plant Cell. 19, 3705-3722 (2007).
कुशल polyethylene glycol (खूंटी) मॉस की मध्यस्थता परिवर्तन<em> Physcomitrella patens</em
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Liu, Y., Vidali, L. Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens. J. Vis. Exp. (50), e2560, doi:10.3791/2560 (2011).More

Liu, Y., Vidali, L. Efficient Polyethylene Glycol (PEG) Mediated Transformation of the Moss Physcomitrella patens. J. Vis. Exp. (50), e2560, doi:10.3791/2560 (2011).

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