Summary
في هذه المقالة ، وصفنا إجراء الجراحة ونصائح للتعامل مع زرع رقيقة جدا مجموعة microelectrode بوليميد على أساس (PBM - الصفيف) على الجمجمة الماوس لاقتناء عالية الكثافة تصوير الدماغ (EEG) في نموذج الفأر.
Abstract
الكهربائي (EEG) يدل على النشاط الكهربائي في المتوسط من سكان العصبية على مستوى واسع النطاق. ويستخدم على نطاق واسع كأداة رصد الدماغ موسع في علم الأعصاب الإدراكي ، وكذلك أداة لتشخيص الاضطرابات الصرع والنوم في الأعصاب. ومع ذلك ، فإن الآلية الكامنة وراء جيل إيقاع EEG لا تزال تحت الحجاب. أدخلت مؤخرا بوليميد المستندة microelectrode (PBM - الصفيف) للماوس عالية الدقة EEG 1 هي واحدة من المحاكمات للإجابة على الأسئلة على الاشارات العصبية الدماغي على أساس مورد الوراثية الغنية التي تحتوي على نموذج الفأر لتحليل عملية معقدة الجيل EEG. هذا التطبيق من nanofabricated الصفيف PBM لجمجمة الفأر هو أداة فعالة لجمع واسع النطاق نشاط المخ لدى الفئران المعدلة وراثيا ، وتتسع لتحديد يرتبط العصبية على إيقاعات EEG معينة بالتعاون مع السلوك. لكن في سماكة رقيقة جدا وبنية متشعبة يسبب متاعب في التعامل مع وغرس الصفيف PBM. عرضت في شريط الفيديو ، ووصف خطوات إعداد وجراحة لزرع الصفيف PBM على جمجمة فأر خطوة بخطوة. كما يتم توفير معالجة وجراحة نصائح لمساعدة الباحثين ينجح في زرع.
Protocol
1. ملخص
C57BL/6J -- الفئران 129S4/SvJae الهجين (12 ~ 15 أسابيع من العمر) هي تخدير مع الكيتامين (120 ملغم / كغم IP) وزيلازين (6 ملغ / كغ ، والملكية الفكرية) كوكتيل. الذيل أو أخمص القدمين معسر تسبق عملية جراحية لتفقد عمق التخدير. تم إصلاح الماوس بواسطة جهاز التجسيمي (ديفيد Kopf الآلات ، موديل 902 ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة). غير قطعي في فروة الرأس على خط الوسط حوالي 25 ملم لفضح الجمجمة تحت العلاج يدوكائين للحد من الألم. هو محو أي حطام على الجمجمة قبالة عن طريق نصائح القطن غارقة في المياه المالحة لتعزيز التزام القطب في الجمجمة. يتم وضع علامة على نقطة وbregma امدا وتدور أحداثه في الطائرة الأفقي نفسه. تم وضع مجموعة بوليميد microelectrode إلى (PBM - الصفيف) في خط الوسط بحيث تجتمع العمودي خط الوسط من الجمجمة. يجب أن يكون موجودا نقطة bregma في منتصف طبقة من ال 5 الأمامي للمجموعة ، PBM. وتستخدم اثنين أو ثلاثة microscrews في الفضاء الخالية في حافة الجمجمة للمساعدة في تأمين موقف القطب مع الاسمنت الأسنان. عن الذين يدعمون الرابط PBM مصفوفة ، ونحن موقف تبختر في منتصف الرأس ، وتغطية ذلك مع الاسمنت الأسنان. بعد المعالجة ، يتم خياطة الجلد قطعي ، وتمنح ما لا يقل عن 5 أيام لتحقيق الانتعاش. أثناء الاسترداد ، ويعيش الفئران في اقفاص فردية مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. بعد الشفاء ، يتم تنفيذ تسجيل EEG. ورعاية الحيوانات والجراحية ، وتسجيل الإجراءات وفقا لمبادئ توجيهية لرعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم ، في أعقاب لعام 1992 من مختبر اللائحة كوريا رعاية الحيوان والمبادئ التوجيهية المرتبطة بها. كانت ملفقة صفائف PBM في هذا المخطوط كما وصفها تشوي. وآخرون. بن. 1 الرجاء الاتصال من الكتاب لاستخدام نفس PBM مصفوفة في الفيديو.
2. إجراء
- إعداد الأدوات الجراحية وأجهزة تعقيم التجسيمي.
- تخدير الفأر مع التخدير (مثل الكيتامين / زيلازين مع جرعة من 120 و 60 ملغم / كغم من الملكية الفكرية ، repectively). الذيل أو أخمص القدمين معسر تسبق عملية جراحية لتفقد عمق التخدير.
- جبل الماوس على جهاز التجسيمي بوضع قضبان الأذن في قناة الأذن الماوس ، وإحكام تثبيته في مكانه. ويمكن تغطية العينين مع هلام حيويا (مثل الفازلين) للحفاظ على العيون من تجفيف بواسطة ضوء عملية جراحية. بعد ترطيب رأس الفأر مع الايثانول 70 ٪ ، حلق الفراء قبالة رأسها.
- شق الرأس حوالي 25 ملم مع فروة الرأس. فمن المستحب أن تطبق على كمية قليلة من 2 ٪ ليدوكائين هيدروكلوريد تحت فروة الرأس. قرصة الجلد مع المشابك الصغيرة (أدوات العلوم الجميلة (الولايات المتحدة) ، وشركة ، 18052-03 ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة) للحفاظ على شق مفتوحة على مصراعيها.
- محو أي حطام الأنسجة المتبقية في الجمجمة مع مسحات القطن غارقة في المياه المالحة تعزيز الانضمام للمجموعة ، PBM في الجمجمة. باستخدام بيروكسيد لإزالة بقايا الغشاء هو أيضا فعالة.
- العثور على نقطة وbregma امدا على الجمجمة ، ووضع علامة عليها مع القلم علامة القائم على النفط. ضع PBM مصفوفة بحيث خط الوسط لالرأسي يفي خط الوسط من الجمجمة كما هو مبين في الشكل 1. موقف bregma في منتصف طبقة ال 5 من الأمامي للمجموعة ، PBM مع قطرة واحدة من مياه الحنفية. المسحة القطب الفيلم بعناية من الإنسي إلى الوحشي على لتحسين التقيد. من أجل المساعدة على عصا القطب تشديد الفيلم على الجمجمة ، وينبغي أن يكون الفيلم القطب يجف تماما على الجمجمة. قطب الفيلم لا يزال لتكون ثابتة على الجمجمة بالقوة فان دير فال. عند إعادة تحديد المواقع القطب ، وآخر قطرة من ماء الصنبور هو ضروري لمنع تمزق من القطب.
الشكل 1 (يسار) وPBM مصفوفة على الجمجمة الماوس. المحور anterio الخلفي للمجموعة ، PBM يطابق الخط الفاصل بين bregma (BP) ، ونقطة لامدا (LP). (يمين) ان مواقف القطب المفترضة على الماوس سطح الدماغ. تشريح الفأر مجزأة من 3 - D قاعدة بيانات التصوير بالرنين المغناطيسي أطلس رقمي للدماغ الفأر الكبار C57BL/6J المنتجة في مختبر بروكهافن الوطني والمواقع الكهربائي يتم وضع علامة وفقا لقياس التجسيمي. وتتميز الأرض (G) والمرجعية (المرجع) الأقطاب الكهربائية في الشكل الصحيح. - علامة لا يقل عن ثلاثة مواقع على مساحة مفتوحة من الجمجمة ، ومن ثم جعل ثقوب في تلك المواقع باستخدام حفر الأسنان لتحديد المواقع لدعم microscrews. هذه microscrews يكون لها دور في دعم ومسماك ميكانيكيا الاسمنت الأسنان على الجمجمة. وهناك حاجة اضافية الحذر أثناء الحفر. منذ الماوس الجمجمة يتألف من طبقات رقيقة ، ويمكن بسهولة أن يحدث نزيف أثناء الحفر. عندما يحدث نزيف ، والتوقف عن الحفر وتطبق كمية صغيرة من مسحوق مرقئ في حفرة.
- تطبيق الاسمنت الاكريليك الأسنان (فيرتكس الأسنان ، فيرتكس الذاتي المعالجة ، وهولندا) لتغطية PBM مصفوفة ، ومسامير الربط ، وبقية الجمجمة. إعداد الاسمنت الأسنان في ج لاصق ولزجondition.
- موقف عصا جامدة بوصفها تبختر في منتصف الرأس باستخدام الغراء قوية (على سبيل المثال ، وكتايت ، هنكل وكتايت كورب ، دبلن ، ايرلندا). وضعت على الوجهين شريط لاصق على الجزء الخلفي من الطائرة الموصل. التلاعب في موقف موصل PBM مصفوفة للتواصل مع غيض من تبختر. وينبغي أن المسافة العمودية بين الجمجمة وموصل تكون أكثر من 5 ملم. العصا الطائرة موصل وغيض من عصا باستخدام الغراء القوي لتحسين الالتصاق.
- تأكد من أن شفي تماما من الاسمنت الأسنان. ثم تطبيق الاسمنت الأسنان الاكريليك على الجمجمة ومؤخر الطائرة الموصل لتأمين الموصل إلى الجمجمة.
- إزالة المشابك الصغيرة. قطعي خياطة الجلد ، مع الألياف خياطة تعقيمها. إزالة الماوس من الجهاز. قد تنطبق اضافية الاسمنت الاكريليك الأسنان لحماية الجمجمة المكشوفة. تطبيق المضادات الحيوية (مرهم fucidin دونغ وها الصيدلة ، وكوريا الجنوبية) حول الاسمنت وخياطة الجلد.
- ضع الماوس في قفص تعقيمها حتى يستعيد وزنه الأصلي الجسم (حوالي 5 إلى 7 أيام). فمن المستحسن عدم إدخال أي الاصحاب القفص.
- بعد الانتعاش ، وتوصيل الماوس بواسطة خفيفة الوزن موصل الدوائر المطبوعة (PCB) إلى مجلس headbox نظام مكبر للصوت EEG الأقنية (Synamps 2 ، نورث كارولينا ، الولايات المتحدة الأمريكية) في قفص خاص بها. ينبغي أن يعامل الخطوط التي تربط بعناية بحيث لا يحصل متشابكة.
- بعد 1 ساعة من التعود ، نفذ تسجيل EEG. تفحص 4.4. (نورث كارولينا ، الولايات المتحدة الأمريكية) واستخدام البرمجيات في اقتناء هذه التجربة. ويظهر تتبع الوقت النموذجي مجموعة من الماوس EEG في الشكل 2. فمن المستحسن لتسجيل الفيديو لربط سلوك الماوس.
- ويمكن تحليل الإشارات التي حصلت عليها MATLAB (MathWorks ، ناتيك ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية) لإنتاج الخريطة الطوبوغرافية الدماغ. وتظهر طوبوغرافيات عينة من خريطة الطاقة في المخ EEG الماوس في الشكل 3.
3. ممثل النتائج
إذا أجريت بشكل صحيح العمليات الجراحية المذكورة أعلاه ، سيتم تسجيل 40 قنوات الماوس EEG يؤديها بنجاح دون القنوات السيئة. تبين الأرقام التالية ممثل آثار EEG الخام والخرائط الطبوغرافية.
الشكل 2. تتبع عينة من الاستيلاء غياب التخطيط الدماغي الناجم عن الحقن التي تعاني γ - بيوتيرولاكتون (GBL ، 50mg/kg ، والملكية الفكرية). شريط أحمر يدل على تصاعد الموجة وتصريفات (SWDS) خلال الاستيلاء الغياب. المحاور الأفقية والعمودية تشير إلى الوقت والجهد ، على التوالي. عدد يتبع مونتاج قناة محددة في الشكل. 1 (يمين).
الشكل 3 ، والخرائط الطبوغرافية تبين قوة هرتز 2-6 التوزيع. القيمة في colorbar يمثل مقياس لون الخريطة السلطة. أثناء تصاعد الموجة وتصريفات (SWDS) الناجم عن γ - بيوتيرولاكتون (GBL ، 50mg/kg ، والملكية الفكرية) ، والسلطة في مناطق واسعة الجبهي القشرية زيادة كبيرة بالمقارنة مع السلطة قبل الحقن GBL (الأساس).
Discussion
نحن هنا التقرير العمليات الجراحية وتسجيل للحصول على كثافة عالية في التحرك بحرية EEG الفئران. هذه الطريقة تمكننا من الحصول على خرائط المخ وظيفية من الفأر نموذج لدراسة الآليات الجزيئية من 1،2 إيقاعية عفوية أو أنشطة الحدث الدماغ ذات الصلة.
الاستحواذ على كل القنوات في الصفيف ، PBM هو شرط ضروري للحصول على كامل خرائط الدماغ ، مما يجعل غير آمن للاتصال في كل قناة وصعبة للغاية. للحفاظ على الاتصال المستمر للقناة في الجمجمة ، تم العثور على الإجراءات التالية لتكون هامة. بادئ ذي بدء ، قد أي حطام الأنسجة على الجمجمة الى جانب مجموعة من القطب الجمجمة. وبالتالي من المهم جدا لإزالة كافة الانقاض الأنسجة مع مسحات القطن المعقم وتجفيف سطح الجمجمة. ثانيا ، قدرة الصفيف PBM التي يمكن أن تلتصق على سطح الجمجمة هو القوة فان دير فال. يقترح تطبيق قطرة من مياه الصنبور على الجمجمة لبناء طبقة المياه قبل ان يتم تطبيق PBM - الصفيف إلى الجمجمة. ثالثا ، اللزوجة حق الاسمنت الأسنان مهم جدا. إذا كان سيلان جدا ، قد يكون بناء طبقة عازلة تحت الصفيف PBM. إذا كانت كثيفة جدا ، فإن سقوط الاسمنت الأسنان بسهولة وبصرف النظر عن الجمجمة بسبب وزنه. وأخيرا ، ينبغي زرعها على الأقل ثلاثة microscrews دعم على الجمجمة لجعل الاسمنت الأسنان بإحكام في الجمجمة. وmicroscrews دعم تصمد الاسمنت الأسنان وتأمين headstage ، وهو أمر ضروري على المدى الطويل الدراسة.
سيكون محدودا تطبيق الصفيف PBM لدراسة المزمن مع فئران بالغة نظرا لحجمها ووزنها. بناء على خبرتنا ، والفئران أثقل من 25 غراما كافية للاستخدام. كما مزيد من الطلبات ، من خلال مساحة فارغة بين فروع في الصفيف PBM لدينا ، يمكن للمرء أن أعرض الأقطاب الثانوية للتسجيل أو لغرض التشويق.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بدعم من منحة كيغالي (2E21510) ، البرنامج الوطني للعلماء الشرف من وزارة التربية والتعليم ، وبحوث التكنولوجيا الأصل برنامج لعلوم المخ من خلال مؤسسة البحوث الوطنية لكوريا الجنوبية التي تمولها وزارة التعليم والعلوم والتكنولوجيا (2010-0018944).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γbutyrolactone | Sigma-Aldrich | H7629-500G |
References
- Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. S. High resolution Electroencephalography in Freely Moving Mice. J Neurophysiol. , Forthcoming.
- Lee, M., Shin, H. S., Choi, J. H. Simultaneous recording of brain activity and functional connectivity in the mouse brain. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2934-2936 (2009).
