Summary
Neste artigo, descrevemos o procedimento de cirurgia e tratamento de dicas para implantação de ultra-fina matriz de microeletrodos poliimida-based (PBM-array) no crânio do rato para a aquisição de alta densidade encefalografia (EEG) em um modelo de mouse.
Abstract
Eletroencefalograma (EEG) indica a média de atividade elétrica das populações neuronal em um nível de grande escala. É amplamente utilizado como uma ferramenta não-invasivo de monitorização cerebral em neurociência cognitiva, bem como uma ferramenta de diagnóstico para a epilepsia e distúrbios do sono em neurologia. No entanto, o mecanismo subjacente de geração de ritmo EEG ainda está sob o véu. Introduziu recentemente microeletrodo poliimida-based (PBM-array) para mouse de alta resolução EEG 1 é um dos ensaios para responder às questões neurofisiológicas em sinais EEG com base em um rico recurso genético que contém o modelo do rato para a análise do processo de geração de complexos EEG. Esta aplicação de nanofabricated PBM-array ao crânio do mouse é uma ferramenta eficiente para a coleta em larga escala a atividade cerebral de camundongos transgênicos e acomoda a identificar os correlatos neurais a certos ritmos EEG em conjunto com o comportamento. No entanto a sua espessura ultra-fina e estrutura bifurcada causar problemas no manuseio e implantação de PBM-array. No vídeo apresentado, as etapas de preparação e cirurgia para a implantação de PBM-array em um crânio do rato são descritas passo a passo. Manuseio e cirurgia dicas para ajudar os pesquisadores a ter sucesso na implantação também são fornecidos.
Protocol
1. Sumário
C57BL/6J - ratos 129S4/SvJae híbrido (12 ~ 15 semanas de idade) são anestesiados com cetamina (120 mg / kg ip) e xilazina (6 mg / kg, ip) cocktail. Beliscar a cauda ou dedo do pé precede a cirurgia para inspecionar a profundidade da anestesia. O mouse é fixada pelo aparelho estereotáxico (David Kopf Instruments, modelo 902, Califórnia, EUA). O couro cabeludo é incisada na linha média cerca de 25 mm para expor o crânio sob o tratamento de lidocaína para diminuição da dor. Quaisquer detritos sobre o crânio é varrido por dicas de solução salina, algodão embebido para melhorar a aderência do eletrodo para o crânio. Os pontos bregma e lambda são marcadas e definidas no mesmo plano horizontal. O conjunto de microeletrodos poliimida base (PBM-array) é posicionado de modo que a sua linha média vertical encontra a linha média do crânio. O ponto bregma deve estar localizado no meio da camada de 5 ª a anterior de PBM-array. Dois ou três microparafusos são usados no espaço nulo na borda do crânio para ajudar a proteger a posição do eletrodo com cimento dental. Para sustentar o conector PBM-matriz, que a posição de uma strut no meio da cabeça, e cobri-lo com cimento dental. Após a cura, a pele é suturada incisão, e pelo menos cinco dias são dadas para a recuperação. Durante a recuperação, os ratos estão alojados em gaiolas individuais com livre acesso a comida e água. Após a recuperação, gravação de EEG é realizado. Procedimentos de cuidados com os animais, cirúrgicos e de gravação estavam de acordo com as diretrizes para a Animal Care Institucional e Comitê Use, seguindo lei de 1992 do Laboratório Coréia Regulamentos Animal Care e diretrizes associados. As matrizes PBM-neste manuscrito foram fabricados, como descrito por Choi. et. al. 1 Entre em contato com os autores a usar a mesma matriz de PBM no vídeo.
2. Procedimento
- Preparar os instrumentos e aparelhos cirúrgicos esterilizados estereotáxica.
- Anestesiar o rato com anestesia (por exemplo, ketamina / xilazina com uma dose de 120 e 60 mg / kg ip, respectivamente). Beliscar a cauda ou dedo do pé precede a cirurgia para inspecionar a profundidade da anestesia.
- Monte o mouse sobre o aparelho estereotáxico, colocando barras de ouvido no canal do rato orelha e apertando-o no lugar. Os olhos podem ser cobertos com geléia biocompatível (por exemplo, vaselina) para manter os olhos sequem a luz por cirurgia. Após hidratação a cabeça do rato com etanol 70%, raspar os pêlos fora de sua cabeça.
- Inciso da cabeça cerca de 25 mm com um couro cabeludo. É recomendável aplicar uma pequena quantidade de cloridrato de lidocaína a 2% sob o couro cabeludo. Beliscar a pele com pinças micro (Ferramentas Ciência Fine (EUA), Inc., 18052-03, Califórnia, EUA) para manter a incisão aberta.
- Limpe os restos de tecido remanescente no crânio com compressas de algodão embebido com solução salina melhorar a aderência do PBM-array para o crânio. Utilizando peróxido para remover o resíduo da membrana também é eficaz.
- Encontre o bregma e lambda pontos no crânio, e marcá-los com uma caneta à base de óleo. Coloque o PBM-matriz de modo que sua linha média vertical encontra a linha média do crânio, como mostrado na Figura 1. Posição do bregma no meio da camada de 5 ª a anterior de PBM-array com uma gota de água da torneira. Swab eletrodo o filme do medial para lateral com cuidado para melhor aderência. A fim de ajudar o filme mais apertado vara eletrodo para o crânio, o eletrodo de filme deve estar completamente seca no crânio. O eletrodo de filme continua a ser fixado no crânio por força de van der Waals. Quando re-posicionamento do eletrodo, mais uma gota de água da torneira é necessário para evitar que o eletrodo de ser rasgado.
Figura 1. (Esquerda) A PBM-array no crânio do rato. O eixo ântero-posterior do PBM-array corresponde a linha entre o bregma (BP) e pontos de lambda (LP). (Direito) O suposto posições de eletrodos na superfície do cérebro do rato. A anatomia do rato são segmentados da 3-D digital de banco de dados de ressonância magnética atlas de um cérebro adulto do rato C57BL/6J produzido em laboratório nacional Brookhaven e os locais de eletrodos são marcadas de acordo com a medição estereotáxica. Solo (G) e de referência (Ref) eletrodos estão marcados na figura à direita. - Marcar pelo menos três posições na área aberta do crânio, e depois fazer buracos nesses locais usando uma broca de dentista para o posicionamento dos microparafusos de apoio. Estes microparafusos têm um papel de balaústres e mecanicamente apoio do cimento dental no crânio. Cuidado extra é necessária durante a perfuração. Uma vez que o crânio do rato consiste em camadas finas, a hemorragia pode ocorrer facilmente durante a perfuração. Quando o sangramento acontece, pare de perfuração e aplicar pequena quantidade de pó hemostático no buraco.
- Aplique o cimento acrílico dental (Vertex-Dental, Vertex auto-cura, Holanda) para cobrir o PBM-array, parafusos âncora, eo resto do crânio. Prepare o cimento odontológico em um c gluey e viscososondition.
- Posição uma vara rígida como um suporte no meio da cabeça com cola forte (por exemplo, Loctite, Henkel Loctite Corp, Dublin, Irlanda). Coloque fita dupla face adesiva na parte traseira do avião conector. Manipular a posição do conector PBM-array para conectar-se com a ponta do suporte. A distância vertical entre o crânio eo conector deve ser superior a 5 mm. Ater ao plano conector ea ponta da vara com cola forte para melhor adesão.
- Certifique-se que o cimento dental é completamente curado. Em seguida, aplique o cimento dental de acrílico, sobre o crânio e parte traseira do avião conector para proteger o conector para o crânio.
- Remova os grampos micro. Sutura incisão da pele com fibra de costura esterilizada. Remova o mouse do aparelho. Você pode aplicar cimento acrílico dental extras para proteger o crânio exposto. Aplicar um (pomada fucidin, Dong Farmácia Wha, Coréia do Sul) antibiótico ao redor do cimento e da pele suturada.
- Posicione o mouse em uma gaiola esterilizados até que recupera seu peso original (aproximadamente 5 a 7 dias). Recomenda-se não introduzir quaisquer companheiros de gaiola.
- Após a recuperação, conecte o mouse por um circuito impresso leve conector da placa (PCB) para a caixa de entrada de um sistema amplificador multicanal EEG (Synamps 2, North Carolina, EUA), em sua própria gaiola. As linhas de conexão deverão ser tratados com cuidado para não se emaranhar.
- Após uma hora de habituação, executar a gravação de EEG. Scan 4.4. (Carolina do Norte, EUA), software de aquisição foi utilizado neste experimento. Um conjunto traço típico tempo de rato EEG é mostrado na Figura 2. Recomenda-se a log o vídeo para relacionar o comportamento do mouse.
- Sinal obtido pode ser analisado pelo MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EUA) para produzir o mapa topográfico do cérebro. Topografias amostra de mapa de energia EEG do cérebro do rato são mostrados na Figura 3.
3. Resultados representante
Se acima procedimentos cirúrgicos são realizados corretamente, 40 canais de gravação do mouse EEG será realizada com sucesso sem canais ruim. Figuras a seguir mostram o representante primas traços EEG e mapas topográficos.
Figura 2. Um traço amostra de crise de ausência EEG experimentando induzida pela injeção γ-butirolactona (GBL, 50mg/kg, ip). Red barra indica espícula-onda e descargas (SWDS) durante a crise de ausência. Os eixos horizontais e verticais indicam tempo e tensão, respectivamente. O número segue a montagem de canais definidos na figura. 1 (direita).
Figura 3. Os mapas topográficos indicam a distribuição de energia 06/02 Hz. O valor no colorbar representa a escala de cores do mapa de energia. Durante espícula-onda e descargas (SWDS) induzida por γ-butirolactona (GBL, 50mg/kg, ip), o poder nas regiões cortical frontoparietal grandes aumentar significativamente em comparação com a alimentação antes de GBL injeção (Baseline).
Discussion
Aqui relatamos os procedimentos cirúrgicos e de gravação para a aquisição de alta densidade EEG em ratos movimentando-se livremente. Este método permite-nos obter mapas funcional do cérebro a partir do modelo do rato para estudar os mecanismos moleculares de 1,2 rítmica espontânea ou atividades do evento relacionado cérebro.
Aquisição de todos os canais no PBM-matriz é uma condição necessária para obter o mapeamento do cérebro inteiro, porém, fazer um contato seguro para cada canal é muito desafiador. Para manter contato constante do canal para o crânio, os seguintes procedimentos são encontrados para ser importante. Primeiro de tudo, todos os restos de tecido no crânio pode separar o eletrodo do crânio. Por isso, é muito importante para remover todos os restos de tecido com cotonetes esterilizados e secar a superfície do crânio. Em segundo lugar, a capacidade de PBM-array que pode aderir à superfície do crânio é van der Waals força. Sugere-se aplicar uma gota de água da torneira no crânio para construir uma camada de água antes de aplicar PBM-array para o crânio. Em terceiro lugar, a viscosidade direito de cimento dental é muito importante. Se ele for muito corrimento, pode construir uma camada isolante sob o PBM-array. Se for muito densa, o cimento dental vai cair facilmente separados do crânio devido ao seu próprio peso. Por fim, pelo menos três microparafusos de apoio devem ser implantados no crânio para fazer o cimento dental fortemente ligada ao crânio. Os microparafusos apoio segurar o cimento dental e seguro o headstage, que é essencial para o estudo de longo prazo.
A aplicação de PBM-array será limitado para o estudo crônico com ratos adultos, devido ao seu tamanho e peso. Baseado em nossa experiência, os camundongos mais pesado do que 25 g são adequados para uso. Como outras aplicações, através do espaço nulo entre os ramos em nosso PBM-array, pode-se introduzir eletrodos secundário para a gravação ou a finalidade de estimulação.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Apoiada por KIST Grant (2E21510), o programa Cientista Nacional de Honra do Ministério da Educação e do Programa de Pesquisa para a Ciência Tecnologia Original cérebro através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coréia financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2010-0018944).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γbutyrolactone | Sigma-Aldrich | H7629-500G |
References
- Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. S. High resolution Electroencephalography in Freely Moving Mice. J Neurophysiol. , Forthcoming.
- Lee, M., Shin, H. S., Choi, J. H. Simultaneous recording of brain activity and functional connectivity in the mouse brain. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2934-2936 (2009).
