Summary
In questo articolo, abbiamo descritto la procedura di chirurgia e la movimentazione suggerimenti per l'impianto di ultra-sottile a base di poliammide array di microelettrodi (PBM-array) sul cranio del mouse per l'acquisizione ad alta densità encefalografia (EEG) in un modello murino.
Abstract
Elettroencefalogramma (EEG) indica l'attività elettrica media delle popolazioni neuronali su larga scala di livello. E 'ampiamente utilizzato come uno strumento di monitoraggio non invasivo del cervello in neuroscienze cognitive, nonché come strumento diagnostico per i disturbi del sonno ed epilessia in neurologia. Tuttavia, il meccanismo alla base della generazione di ritmo EEG è ancora sotto il velo. Recentemente introdotto in poliammide a base di microelettrodi (PBM-array) per mouse ad alta risoluzione EEG 1 è uno dei processi per rispondere alle domande sui segnali EEG neurofisiologica basata su una ricca risorsa genetica che contiene il modello di topo per l'analisi del complesso processo di generazione EEG. Questa applicazione di nanofabricated PBM-array a cranio mouse è uno strumento efficace per la raccolta su larga scala l'attività cerebrale di topi transgenici e ospita per identificare i correlati neurali a certi ritmi EEG in collaborazione con il comportamento. Tuttavia il suo ultra-sottile spessore e la struttura biforcata causare una difficoltà nella gestione e impianto di PBM-array. Nel video presentato, le fasi di preparazione e chirurgia per l'impianto di PBM-array su un cranio del mouse sono descritte passo per passo. Manipolazione Consigli e chirurgia per aiutare i ricercatori riescono a impianto sono anche previste.
Protocol
1. Riassunto
C57BL/6J - topi 129S4/SvJae ibridi (12 ~ 15 settimane di età) sono anestetizzati con ketamina (120 mg / kg ip) e xilazina (6 mg / kg, ip) cocktail. Pizzicare la coda o piede precede l'intervento di ispezionare la profondità dell'anestesia. Il mouse è fissato apparato stereotassico (David Kopf Instruments, Modello 902, California, USA). Il cuoio capelluto è incisa sulla linea mediana di circa 25 mm per esporre il cranio con il trattamento lidocaina per riduzione del dolore. I detriti sul cranio è spazzato via dalla salina di cotone imbevuti di suggerimenti per migliorare l'aderenza degli elettrodi al cranio. I punti di bregma e lambda sono marcati e impostare sullo stesso piano orizzontale. L'array di microelettrodi a base poliammide (PBM-array) è posizionato in modo che la sua linea mediana verticale incontra la linea mediana del cranio. Il punto bregma deve essere posizionato al centro dello strato 5 di quella anteriore del PBM-array. Due o tre microviti sono utilizzati allo spazio nullo nel bordo del cranio per proteggere la posizione degli elettrodi con del cemento dentale. Per puntellare il PBM-array connettore, abbiamo la posizione di un puntone sul centro della testa, e coprire con del cemento dentale. Dopo la polimerizzazione, la pelle incisa viene suturata, e almeno 5 giorni sono dati per il recupero. Durante il recupero, i topi sono alloggiati in gabbie singole, con libero accesso a cibo e acqua. Dopo il recupero, la registrazione EEG viene eseguita. Procedure di cura degli animali, chirurgica, e la registrazione sono stati in conformità con le linee guida per la cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa, a seguito di legge del 1992 del Regolamento di cura degli animali di laboratorio Corea e linee guida associate. Il PBM-array in questo manoscritto sono state realizzate come descritto da Choi. et. al. 1 Si prega di contattare gli autori di utilizzare lo stesso PBM-array nel video.
2. Procedura
- Preparare gli strumenti chirurgici sterilizzati e apparecchi stereotassica.
- Anestetizzare il mouse con l'anestesia (per esempio, ketamina / xylazina con una dose di 120 e 60 mg / kg ip, nell'ordine). Pizzicare la coda o piede precede l'intervento di ispezionare la profondità dell'anestesia.
- Montare il mouse sul apparato stereotassico inserendo barre orecchio nel canale uditivo del topo e di serraggio in posizione. Gli occhi possono essere coperti con biocompatibile gelatina (es. vaselina) per mantenere l'idratazione degli occhi dalla luce intervento chirurgico. Dopo idratante testa del mouse con il 70% di etanolo, accorciare il pelo fuori la testa.
- Incise il capo di circa 25 mm con un cuoio capelluto. Si consiglia di applicare una piccola quantità di lidocaina cloridrato al 2% sotto il cuoio capelluto. Pizzicare la pelle con fascette micro (Strumenti Scienze Fine (USA), Inc., 18052-03, California, USA) per mantenere l'incisione aperta.
- Pulire tutti i residui di tessuto residuo sul cranio con soluzione salina tamponi di cotone imbevuti di migliorare l'aderenza del PBM-array al cranio. Usando il perossido per rimuovere il residuo della membrana è anche efficace.
- Trova il bregma e punti di lambda sul cranio, e li segnano con un olio a base di pennarello. Posizionare il PBM-array in modo che la linea mediana verticale incontra la linea mediana del cranio, come mostrato nella Figura 1. Posizionare il bregma al centro dello strato 5 ° del anteriore del PBM-array con una goccia di acqua del rubinetto. Tampone l'elettrodo pellicola dal mediale al laterale con attenzione per una migliore aderenza. Al fine di aiutare l'elettrodo stretto film di aderire al cranio, l'elettrodo film dovrebbe essere completamente asciutto sul cranio. L'elettrodo film rimane da fissare sul cranio con la forza di van der Waals. Quando ri-posizionamento dell'elettrodo, un'altra goccia di acqua di rubinetto è necessaria per evitare l'elettrodo di essere strappato.
Figura 1. (Sinistra) Un PBM-array sul cranio del mouse. Il anterio-posteriore asse del PBM-array corrisponde al confine tra bregma (BP) e punti di lambda (LP). (Destra) Le posizioni putativo elettrodo sulla superficie del cervello del mouse. L'anatomia del mouse sono segmentati dal-3 D banca dati MRI atlante digitale di un cervello di topo adulto C57BL/6J prodotto nel laboratorio nazionale di Brookhaven e le posizioni degli elettrodi sono contrassegnati secondo la misura stereotassica. Terra (G) e di riferimento (Ref) elettrodi sono contrassegnati nella figura a destra. - Segna almeno tre posizioni sulla zona aperta del cranio, e poi fare buchi in quelle posizioni con un trapano dentistico per il posizionamento delle microviti di sostegno. Queste microviti hanno un ruolo di candeliere e meccanicamente sostenere il cemento dentale sul cranio. Cautela supplementare è necessario durante la perforazione. Dal momento che il cranio del mouse è composto da strati sottili, l'emorragia si può verificare facilmente durante la perforazione. Quando il sanguinamento caso, interrompere la foratura e applicare piccola quantità di polvere emostatico nel foro.
- Applicare il cemento dentale acrilico (Vertex-Dental, Vertex autopolimerizzante, Paesi Bassi) per coprire il PBM-array, viti di ancoraggio, e il resto del cranio. Preparare il cemento dentale in un c collosa e viscosoondition.
- Posizione di un bastone rigido come un puntone sul centro della testa con colla forte (per esempio, Loctite, Henkel Loctite Corp, Dublino, Irlanda). Mettere a doppia faccia nastro adesivo sul retro del piano connettore. Manipolare il PBM-array posizione del connettore per il collegamento con la punta del puntone. La distanza verticale tra il cranio e il connettore deve essere superiore a 5 mm. Stick piano connettore e la punta del bastone con colla forte per una migliore aderenza.
- Assicurarsi che il cemento dentale è completamente guarito. Quindi applicare il cemento dentale acrilico sopra il cranio e la parte posteriore del piano connettore per fissare il connettore al cranio.
- Rimuovere le pinze micro. Sutura incisa la pelle con cuciture in fibra sterilizzati. Rimuovere il mouse dall'apparecchio. Si può applicare in più cemento dentale acrilico per proteggere il cranio scoperto. Applicare un antibiotico (unguento fucidin, Dong Wha Farmacia, Corea del Sud) in tutto il cemento e la pelle suturata.
- Posizionare il mouse in una gabbia fino a quando non sterilizzato recupera il suo peso originale corporeo (circa 5 a 7 giorni). Si raccomanda di non introdurre compagni di gabbia.
- Dopo il recupero, collegare il mouse da un leggero circuito stampato (PCB) connettore alla cassa d'afflusso di un sistema multicanale amplificatore EEG (Synamps 2, North Carolina, USA) nella sua gabbietta. Le linee di collegamento devono essere trattati con cura in modo da non impigliarsi.
- Dopo 1 ora di assuefazione, effettuare la registrazione EEG. Scan 4.4. (North Carolina, USA), software di acquisizione è stato utilizzato in questo esperimento. Un tipico insieme traccia temporale di topo EEG è illustrato nella figura 2. Si consiglia di registrare i video di mettere in relazione il comportamento del mouse.
- Segnale ottenuto può essere analizzato da MATLAB (The MathWorks, Natick, MA, USA) per produrre la carta topografica del cervello. Topografie campione della mappa della potenza EEG di cervello di topo sono mostrati in Figura 3.
3. Rappresentante Risultati
Se sopra gli interventi chirurgici sono correttamente condotto, mouse 40 canali di registrazione EEG sarà effettuato con successo senza canali male. Figure che seguono mostrano il rappresentante prime tracce EEG e mappe topografiche.
Figura 2. Una traccia campione di EEG sequestro assenza vivendo indotto da iniezione γ-butirrolattone (GBL, 50mg/kg, ip). Barra rossa indica spike-wave e scarichi (SWDs) durante la crisi epilettica. Gli assi orizzontali e verticali indicano il tempo e la tensione, rispettivamente. Il numero segue il montaggio dei canali definiti nella figura. 1 (a destra).
Figura 3. Le carte topografiche indicano la potenza 2-6 Hz distribuzione. Il valore nella barra colorata rappresenta la scala della mappa della potenza del colore. Durante spike-wave e scarichi (SWDs) indotta da γ-butirrolattone (GBL, 50mg/kg, ip), il potere nelle regioni corticali frontoparietale grandi aumentare in maniera significativa rispetto al potere prima dell'iniezione GBL (Baseline).
Discussion
Riportiamo gli interventi chirurgici e la registrazione di acquisire ad alta densità EEG in topi liberi di muoversi. Questo metodo ci permette di ottenere mappe funzionale del cervello da modello di topo per studiare i meccanismi molecolari di spontanea 1,2 ritmica o attività cerebrale di eventi correlati.
L'acquisizione di tutti i canali della PBM-array è una condizione necessaria per ottenere la mappatura intero cervello, ma facendo un contatto sicuro per ogni canale è molto impegnativo. Per mantenere il contatto costante del canale al cranio, le seguenti procedure si trovano ad essere importante. Prima di tutto, tutti i residui di tessuto sul cranio può impostare a parte l'elettrodo dal cranio. Quindi è molto importante per rimuovere tutti i frammenti di tessuto con tamponi di cotone sterilizzati e asciugare la superficie del cranio. In secondo luogo, la capacità di PBM-array che possono aderire alla superficie del cranio è forza di van der Waals. Si consiglia di applicare una goccia di acqua di rubinetto sul cranio di costruire strato di acqua prima di applicare PBM-array al cranio. In terzo luogo, la viscosità diritto di cemento dentale è molto importante. Se è troppo liquida, si può costruire uno strato isolante sotto il PBM-array. Se è troppo densa, il cemento dentale facilmente cadere a parte il cranio grazie al suo peso. Infine, almeno tre microviti di supporto devono essere impiantati sul cranio per fare il cemento dentale strettamente legata al cranio. Le microviti supporto sorreggere il cemento dentale e fissare il headstage, che è essenziale per studio a lungo termine.
L'applicazione di PBM-array sarà limitata a studiare cronico con topi adulti per le sue dimensioni e peso. Sulla base della nostra esperienza, i topi peso superiore a 25 g sono sufficienti per l'uso. Come ulteriori applicazioni, attraverso lo spazio nullo tra i rami della nostra PBM-array, si può introdurre elettrodi secondari per la registrazione o lo scopo di stimolazione.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Supportato da KIST Grant (2E21510), il programma di National Honor Scientist del Ministero della Pubblica Istruzione, e l'originale programma Technology Research for Brain Science attraverso il National Research Foundation della Corea finanziato dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e della Tecnologia (2010-0018944).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| γbutyrolactone | Sigma-Aldrich | H7629-500G |
References
- Choi, J. H., Koch, K. P., Poppendieck, W., Lee, M., Shin, H. S. High resolution Electroencephalography in Freely Moving Mice. J Neurophysiol. , Forthcoming.
- Lee, M., Shin, H. S., Choi, J. H. Simultaneous recording of brain activity and functional connectivity in the mouse brain. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 2934-2936 (2009).
