Summary
Este método describe la generación de organotípicos culturas del cerebelo y el efecto de ciertos estímulos apoptóticos sobre la viabilidad de los diferentes tipos de células del cerebelo.
Abstract
Cultivos organotípicos de tejido neuronal se introdujeron por primera vez por Hogue en 1947 de 1,2 y han constituido un gran avance en el campo de la neurociencia. Desde entonces, la técnica se desarrolló aún más y actualmente hay muchas formas diferentes de preparar cultivos organotípicos. El método presentado aquí es una adaptación de la descrita por Stoppini et al. Para la preparación de los cortes y de Gogolla et al. Por el procedimiento de tinción 3,4.
Una característica única de esta técnica es que permite estudiar las diferentes partes del cerebro como el hipocampo y cerebelo en su estructura original, proporcionando una gran ventaja sobre los cultivos disociados en el que se interrumpen todas las de la organización celular y las redes neuronales. En el caso de que el cerebelo es aún más favorable, ya que permite el estudio de las células de Purkinje, muy difícil de obtener como cultivo primario disociados. Este método puede ser usado para estudiar algunas características del desarrollo del cerebelo in vitro, así como para los experimentos electrofisiológicos y farmacológicos, tanto de tipo salvaje y ratones mutantes.
El método descrito aquí fue diseñado para estudiar el efecto de los estímulos apoptóticos como ligando de Fas en el cerebelo en desarrollo, mediante la tinción de TUNEL para medir la muerte celular por apoptosis. Si la tinción de TUNEL se combina con marcadores tipo específico de célula, como calbindina de las células de Purkinje, es posible evaluar la muerte celular de una manera la población de células específicas. La tinción calbindina también sirve el propósito de evaluar la calidad de las culturas del cerebelo.
Protocol
1. Organotípicos Culturas del cerebelo:
- Para generar éxito organotípicos culturas cerebelosa utilizar ratones entre P0-P3 o P8-P12. Para nuestro experimento utilizaron ratones en el rango de P8-P12 ya que esta etapa de desarrollo era más apropiado para nuestro estudio.
- Prepare la disección y el medio de cultivo:
- La disección del cerebro y la preparación de corte se llevan a cabo en la baja artificial de sodio líquido cefalorraquídeo (ACSF), que contiene cloruro de calcio 1 mM, 10 mM D-glucosa, 4 mm de cloruro de potasio, cloruro de magnesio 5 mM, bicarbonato de sodio de 26 mm, 246 mm y una solución de sacarosa rojo fenol (1:1000) , pH 7,3. Para esterilizar la solución, se filtra a través de un filtro de 0,22 micras y se almacenan a 4 ° C.
- Rodajas de cerebelo se cultivan en el 75% mínimo indispensable medio de Eagle (MEM), el 25% inactivado por calor suero de caballo, HEPES 25 mM, 1 mM glutamina, glucosa 5 mg / ml, penicilina (100 U / ml) y estreptomicina (100 U / mL). Filtrar el medio a través de un filtro de 0,22 micras y se almacenan a 4 ° C durante un máximo de dos semanas.
- Diseccionar el cerebro en el helado a medio ACSF previamente burbujeado con carbogen (95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono) Tenga en cuenta que la saturación con Carbogen va a cambiar el pH de la solución por lo que pasará de rojo a naranja. La disección se debe realizar en el menor tiempo posible, teniendo cuidado de no dañar la estructura del cerebro.
- Rebanada del cerebro en las secciones sagitales de 400 m con un vibratome.
- Haga un corte sagital con una hoja de afeitar en un hemisferio, tratando de cortar lo menos posible del cerebelo, lo que proporcionará una superficie plana para cortar. La corteza se usa sólo para el apoyo para hacer el corte en lonchas más fácil, pero como el tiempo es un tema importante que es más conveniente para cortar la mitad rostral de la corteza con una cuchilla de afeitar.
- El uso de cianoacrilato (Superglue) para fijar la posición del cerebro en la placa de metal vibratome. Es importante para enfriar la placa de hielo antes de añadir la cola y que se extendió también con la punta del tubo para formar una capa adhesiva delgada. Si hay un exceso de pegamento, que se desprenden de la placa cuando se entra en contacto con la ACSF y la muestra se perderá.
- Una vez que el cerebro está conectado a la placa vibratome, añadir una cantidad suficiente para cubrir los medios de comunicación ACSF el cerebro y la puso debajo de la placa de hielo para mantenerlos fríos.
- Cortar rodajas de 400 micras y la transferencia con una pipeta de plástico Pasteur (corte la punta para ampliarla y evitar daños a los cortes) a una placa de 6 celdas, y la cultura que contiene ACSF en el hielo.
- Separar el cerebelo desde el resto del cerebro con la ayuda de dos jeringas de insulina (jeringas de pequeño diámetro de calibre 28 agujas) bajo el microscopio de disección. Algunos cortes se han unido a un pegamento de los bordes: este es el momento para tratar de eliminar, ya que puede afectar la viabilidad de la división. Es importante hacerlo con cuidado sin dañar la estructura del cerebelo.
- Transferencia de las rodajas de cerebelo a los 6 y placas que contienen de 30 mm se inserta la placa de cultivo con 0,4 micras poros. Añadir 1 ml de medio de cultivo por pozo, que se pre-condicionada por la incubación de al menos 2 horas a 37 ° C y 5% de CO 2 (en el cultivo celular incubadora). Colocar los insertos en la parte superior de los medios de asegurarse de que no hay burbujas de aire atrapadas debajo y luego colocar las rodajas de cerebelo (1-3 por inserto) en la parte superior de los insertos de asegurarse de que estén completamente extendidos y que el líquido no es cubierta ellos. Aspirar el exceso de los medios de comunicación si es necesario. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 cambia el medio de cultivo cada 2 o 3 días. Lo mejor es reemplazar sólo una parte del medio (por ejemplo, el volumen medio) a la vez, ya medio utilizado contiene derivados slice-factores tróficos que son importantes para la supervivencia celular.
2. Fas tratamiento y tinción de las rebanadas del cerebelo:
- Para el experimento de exposición a la apoptosis, que la cultura primero las rodajas durante 5 días cambiando los medios de comunicación en el día in vitro 3 (DIV3). En DIV5 culturas son tratados con 0,5 mg / mL de la Jo2 Fas anticuerpo agonista añadiendo directamente a los medios de comunicación a fin de tener un fondo limpio de la muerte celular ya que los cambios de los medios de comunicación pueden inducir a cierta mortalidad en los cultivos. La mitad de los pozos no se tratan como controles.
- Después de 24 horas retire el material por debajo de los insertos por succión. Para solucionar los cortes, agregar 1 ml de helado un 4% por debajo de PFA y 1 ml por encima de la inserción. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Después de 10 minutos, retire la PFA y lavar brevemente con PBS frío.
- A continuación, retire la PBS y añadir 1 ml y por debajo de 1 ml por encima de la inserción de helado de metanol al 20% en PBS e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar a continuación con PBS y añadir 1 ml por debajo de 1 ml y por encima de la inserción de un 0,5% de Triton X-100 en PBS durante la permeabilización. Se incuba durante un mínimo de 12 horas a 4 ° C.
- Después de permeabilización, bloque con un 20% BSA en PBS durante un mínimo de4 horas a temperatura ambiente o la noche a 4 ° C. En esta etapa, las rebanadas se pueden mantener en solución de bloqueo durante al menos 3 días a 4 ° C.
- Con el fin de manchar las rodajas de corte con cuidado la pieza de la membrana insertar adjunto a la parte del cerebelo y la transferencia a 24 y placas que contienen PBS.
- La inmunotinción se hace de forma secuencial, primero con el reactivo TUNEL durante una hora y luego con el anticuerpo Calbidin noche a la mañana.
- Aspirar el PBS y añadir 250 l de reactivo TUNEL en cada pocillo asegurándose de que cubre toda la superficie del corte. Se incuba a 37 ° C durante una hora en la oscuridad.
- Después de una hora remover la mezcla de TUNEL y lavar con PBS tres veces durante 10 minutos.
- Después del último lavado, eliminar el PBS y añadir 250 l de una dilución 1 / 1000 de la calbindina anticuerpos en PBS e incubar durante la noche a 4 ° C en la oscuridad.
- Eliminar la solución de anticuerpo primario y lavar con PBS tres veces durante 10 minutos.
- Añadir 250 ml del anticuerpo secundario diluido 1 / 500 en PBS y se incuba durante al menos tres horas a temperatura ambiente en la oscuridad. El kit TUNEL usamos está marcado con rojo TMR, por lo tanto, nuestro anticuerpo secundario para calbindina se conjuga con Alexa-488.
- Lavar tres veces durante 10 minutos con PBS y montar los cortes sobre un portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje que contiene DAPI.
- Imagen de las rebanadas con un microscopio confocal utilizando los 488 nm y 561 nm de longitud de onda de excitación de calbindina y TUNEL, respectivamente.
3. Los resultados representativos:
El principal reto de este protocolo es capaz de generar saludables culturas rebanada del cerebelo, sobre todo porque nuestra lectura final será la muerte celular. Una sana cultura aparece como uno donde la capa de células del cuerpo es transparente y permite ver la estructura foliada del cerebelo bajo el microscopio (Figura 1). Después de unos días en la cultura de las rodajas de empezar a células que son delgadas y no neuronales se puede observar la migración fuera de los márgenes de la división. Las células redondas oscuras (la mayoría de los macrófagos probable) que cubren los cortes después de unos días en la cultura, con el tiempo se reducirán en número después de 10-14 días in vitro (Figura 2) 5. La prueba definitiva para la viabilidad de los cortes es para teñir de diferentes marcadores celulares, tales como calbindina de las células de Purkinje. La Figura 3 muestra una imagen representativa microscopio confocal de la capa de células de Purkinje con varios núcleos TUNEL positivos.
Es importante tener en cuenta que incluso si algunas rebanadas recibió un estímulo apoptótico, fueron expuestos sólo durante 24 horas. Esto permitió tiempo suficiente para observar la fragmentación del ADN en las células que mueren con la tinción de TUNEL, pero una capa de células de Purkinje definido todavía estaba presente.
Figura 1. Parte sana del cerebelo en DIV2. Esta imagen muestra la capa de células del cuerpo translúcido y la estructura foliada del cerebelo en una porción saludable.
Figura 2. Parte sana del cerebelo en DIV 7. En esta imagen todavía se puede observar la estructura foliada del cerebelo y la aparición de cuerpos de células oscuras.
Figura 3. Imagen representativa de una rebanada de Fas-cerebelosa tratado. Esta imagen confocal muestra las células de Purkinje se tiñeron con calbindina (verde) y las células apoptóticas positivas para la tinción de TUNEL (rojo). Las células de Purkinje no aparecen en una sola fila, pero se agrupan formando una estructura similar a folio.
Discussion
Este método describe una de las muchas aplicaciones posibles de cultivos organotípicos neuronal y que nos ha permitido estudiar el efecto de los estímulos de apoptosis de tipo salvaje y mutante rodajas de cerebelo.
La parte más crítica de este experimento es ser capaz de generar consistentemente saludable culturas trozo del cerebelo. Los factores clave son la disección y el método de los cortes y la capacidad para llevar a cabo el protocolo en el menor tiempo posible, pero al mismo tiempo teniendo cuidado de no dañar los trozos. Otro factor crucial es la preparación y la composición de los medios de cultivo, estos cultivos son muy sensibles, así que tuvimos que probar varias recetas y las marcas de los medios de comunicación. Incluso los diferentes lotes de suero o cualquier otro componente de los medios de comunicación podría afectar la viabilidad de los sectores. Tenemos los mejores resultados con el suero de caballo de Lot # 480116 Invitrogen.
Una vez que los cortes del cerebelo se generan se puede estudiar el desarrollo del cerebelo, la electrofisiología, la supervivencia de las células solas o en respuesta a estímulos apoptóticos, excitotoxicidad, o la falta de oxígeno. Los estudios comparativos con el tipo salvaje y mutante rebanadas del cerebelo han sido muy profundas en muchos aspectos de la función del cerebelo y el desarrollo.
Disclosures
Todos los animales de trabajo llevado a cabo se realizó de acuerdo con las políticas establecidas por el IACUC. El Instituto Salk es un centro acreditado AAALAC.
Acknowledgments
Este estudio fue financiado en parte por la Fundación Ipsen. IMV es un profesor Sociedad Americana del Cáncer de Biología Molecular, y el titular de la Cátedra Irwin y Joan Jacobs en Ciencias de la vida ejemplar. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del NIH, Fundación Leducq, Fundación Meriaux, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, y HN y Frances C. Berger Fundación. PAS es financiado por McKnight Fondo de Dotación para la Neurociencia y el Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (R01 DA019022). Los autores desean agradecer a Mark Schmitt. Arte gráfico fue diseñado por Jamie T. Simon. Patrocinio fue proporcionado amablemente por Invitrogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Superglue | Krazy Glue | ||
| 6 well / 24 well cell culture plates | Corning | 3506/ 3527 | |
| 30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Biosciences | 554254 | |
| In situ cell death detection kit, TMR red | Roche Group | 12 156 792 910 | |
| Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | |
| Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen | A-11008 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Vibratome | Leica Microsystems | ||
| Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).
