Summary
이 방법은 organotypic 소뇌 문화의 생성 및 다른 소뇌 세포 유형의 생존 능력에 특정 apoptotic 자극의 효과를 설명합니다.
Abstract
의 연결 조직 Organotypic 문화가 처음 1947 년 1,2 호그에 의해 소개되었으며 신경 과학 분야의 주요 돌파구를 형성했습니다. 그 이후,이 기술은 더욱 발전하여 현재 organotypic 문화를 준비하는 방법에는 여러 가지가 있습니다했습니다. 방법은 Stoppini 외에 기술된 하나에서 적응되었다 여기에 제시했습니다. 슬라이스의 준비 및 Gogolla 외에서. 얼룩 절차 3,4하십시오.
이 기법의 독특한 기능은 모든 세포 조직과의 연결 네트워크가 중단되는 dissociated 문화 비해 큰 장점을 제공합니다, 당신이 원래 구조로 해마 또는 소뇌 등 뇌의 다른 부분을 공부 수 있도록하는 것입니다. 그것이 dissociated 기본 문화로 얻을 수 Purkinje 세포의 연구가 매우 어렵습 수 있기 때문에 소뇌의 경우는 훨씬 더 유리한 것입니다. 이 방법은 체외에서 소뇌의 특정 발달 기능을 연구뿐만 아니라, 야생의 종류와 돌연변이 생쥐 모두에서 electrophysiological 및 약리 실험하는 데 사용할 수 있습니다.
방법은 apoptotic 세포 죽음을 측정하는 TUNEL 염색법을 사용하여 이러한 개발 소뇌의 파의 리간드로 apoptotic 자극의 효과를 연구하기 위해 설계되었습니다 여기에 설명되어 있습니다. TUNEL의 얼룩이 Purkinje 세포에 대한 이러한 Calbindin 같은 세포 유형 특정 마커와 결합하는 경우, 그것은 세포 인구 구체적인 방식으로 세포 죽음을 평가하는 것이 가능합니다. Calbindin의 얼룩은 또한 소뇌 문화의 품질을 평가의 목적을 제공합니다.
Protocol
1. Organotypic 소뇌 문화 :
- 성공적으로 생성하려면 organotypic 소뇌 문화 P0 - P3 또는 P8 - P12 사이에 마우스를 사용합니다. 이 발달 단계가 우리의 연구에 대한 더 적절한했기 때문에 우리가 실험을 위해 우리는 P8 - P12 범위에서 마우스를 사용합니다.
- 해부 및 배지 준비 :
- 뇌 해부와 슬라이스 준비는 1mM의 염화칼슘을 포함 낮은 나트륨 인공 뇌척수 (ACSF), 10mM D - 포도당, 4mm짜리 칼륨 염화물, 5mM 마그네슘 염화물, 26mM 나트륨 중탄산염, 246mM 자당 및 페놀 레드 용액 (1:1000)에서 이루어졌습니다 , 산도 7.3. 솔루션을 소독하기 위해 4 0.22 μm의 필터와 저장소를 통해 필터 ° C.를
- 소뇌 조각은 75 % 최소 필수 중간 이글 (멤), 25 % 열 inactivated 말 혈청, 25mM HEPES, 1mM 글루타민, 5mg / ML 포도당, 페니실린 (100 U / ML)과 스트렙토 마이신 (100 U / ML)를 양식하고 있습니다. 2 주간 최대 4 0.22 μm의 필터와 매장 ° C를 통해 매체를 필터링합니다.
- 그것이 빨간색에서 주황색으로 이동 있도록 이전 Carbogen (95 % 산소와 5 % 이산화탄소) 참고로 부풀어 오른 얼음처럼 차가운 ACSF 매체에서 머리를 절개하다, Carbogen 가진 채도는 솔루션의 산도가 변경됩니다. 절개는 뇌의 구조를 손상하지 않도록주의하고 가능한 시간의 최소 금액 수행하여야한다.
- vibratome를 사용하여 400 μm의의 화살 섹션에 머리를 슬라이스.
- 소뇌의 가능한 한 조금 잘라 하나씩 반구에서 면도날과 화살 절단을 확인,이 부러 뜨리 평평한 표면을 제공합니다. 대뇌 피질은 깔끔히 쉽게 지원에 대해서만 사용하지만, 시간이 중요한 문제이기 때문에 그것은 면도날과 피질의 주동이의 절반을 잘라 것이 더 편리입니다.
- 금속 vibratome 판에있는 두뇌의 위치를 수정하는 (Superglue) cyanoacrylate 사용합니다. 접착제를 추가하기 전에 얼음 접시를 진정하고 얇은 접착 층을 형성하기 위해 튜브의 끝부분을 사용하여 잘 확산하는 것이 중요합니다. Superglue의 초과가있다면 그것이 ACSF 및 샘플이 손실됩니다 접촉되면, 그것은 접시에서 분리합니다.
- 일단 두뇌는 두뇌를 커버하고 차가운 유지하는 접시 아래에 얼음을 넣어 충분히 ACSF 미디어를 추가 vibratome 접시에 첨부되어 있습니다.
- 400 μm의 슬라이스 컷 얼음에 ACSF를 포함하는 6 자 세포 배양 판에 플라스틱 파스퇴르 피펫 (그것을 넓혀과 조각에 손상을 피하기 위해 팁을 절단)으로 그들을 전송합니다.
- 해부 현미경이 인슐린 주사기 (소형 직경 28 게이지 바늘과 주사기)의 도움으로 두뇌의 나머지 부분에서 소뇌를 구분한다. 어떤 조각은 Superglue의 가장자리에 첨부해야합니다 : 이것은 슬라이스의 생존에 영향을 미칠 수로를 제거하려고하는 순간이다. 소뇌 구조를 손상시키지 않고 신중하게 그것을하는 것이 중요합니다.
- 0.4 μm의의 모공과 30mm 문화 플레이트 삽입을 포함하는 6 자 접시에 소뇌 조각 전송합니다. 한 문화 미디어의 ML 당 자 37 적어도 2 시간 배양하여 사전에 시설되었다 ° C와 5% CO 2 (세포 배양 인큐베이터에서). 추가 여기 아래에 갇혀있는 공기의 거품이되지 않습니다 그리고 그들이 완전히 확장되었는지 확인하고 삽입 위에 어떠한 액체가 그들을 다루는 없다는 것을 소뇌 조각 (삽입 당 1-3) 장소 확인하는 미디어의 상단에 삽입 놓으십시오. 필요한 경우 미디어의 초과를 대기음. 37 품어 ° C와 5% CO 2 문화 매체마다 2 ~ 3 일 변화. 사용 매체 세포 생존을위한 중요한 슬라이스 - 파생 영양 요소를 포함 이래, 한번에 매체의 일부만 (예 : ½ 볼륨) 교체하는 것이 좋습니다.
2. 파 처리 및 소뇌 조각의 스테 이닝 :
- apoptotic 도전 실험을 위해, 우리는 첫째 문화 체외 3 (DIV3)에서 하루에 미디어를 변경 오일에 대한 슬라이스. DIV5 문화 미디어의 변화 때문에 세포 죽음의 깨끗한 배경을하기 위해 미디어에 직접 추가하여 파의 작용제의 항체 Jo2 0.5 μg / ML로 처리하는이 문화의 일부 사망률을 일으킬 수 있습니다. 우물의 절반은 컨트롤로 치료 남아 있습니다.
- 24 시간 흡입하여 삽입 아래 미디어를 제거한 후. 조각 해결하려면 아래 얼음 차가운 4% PFA 1 ML 및 삽입 위의 1 ML를 추가합니다. 실온에서 10 분 알을 품다.
- 10 분 PFA를 제거하고 차가운 PBS로 세척 후 잠시.
- 다음 PBS를 제거하고 실온에서 5 분간 PBS과 부화에 최고 20 % 차가운 메탄올의 삽입 위의 1 ML의 아래 1 ML를 추가합니다.
- PBS로 다시 세척하고 아래 한 ML 및 permeabilization 위해 PBS에 트리톤 - X - 100 0.5 %의 삽입 위의 1 ML를 추가합니다. 4 12 시간 최소 품어 ° C.
- permeabilization 후 최소 PBS에서 20 % BSA와 차단4 상온에서 시간 또는 4 박 ° C. 이 단계에서는 조각 4 적어도 삼일 ° C.에 대한 차단 용액에 보관 가능
- 슬라이스가 조심스럽게 소뇌 슬라이스에 연결된 삽입 막의 조각을 잘라 PBS를 포함하는 24 잘 접시로 전송 얼룩하기 위해서.
- immunostaining은 다음 1 시간 Calbidin 항체와 하룻밤을 위해 TUNEL 시약 처음에 순차적으로 이루어집니다.
- PBS를 대기음하고 각 잘는 슬라이스의 전체 표면을 커버해야하는 시약으로 TUNEL에서 250 μL를 추가합니다. 어두운 한 시간 동안 37 ° C에서 품어.
- 한 시간 TUNEL 믹스를 제거하고 10 분 동안 PBS로 세 번 씻어 후.
- 마지막 세척 후 PBS를 제거하고 PBS에서 Calbindin 항체의 1천분의 1 희석 250 μL를 추가하고 4 밤새 품어 ° 어둠 속에 C.
- 기본 항체 솔루션을 제거하고 10 분 동안 PBS로 세 번 씻어.
- 이차 항체의 추가 250 μL은 어둠 속에서 실온에서 최소한 세 시간은 PBS와 부화의 1 / 500 희석. 우리가 사용하는 TUNEL 키트는 TMR 빨간색으로 표시되므로 Calbindin위한 보조 항체는 알렉사 - 488에 복합이다.
- PBS로 10 분 동안 세 번 씻고 DAPI를 포함하는 설치 미디어를 사용하여 유리 현미경 슬라이드에 슬라이스를 탑재합니다.
- 각각 488 nm의과 Calbindin 및 TUNEL 위해 561 나노미터 여기 wavelenght를 사용하여 공촛점 현미경으로 이미지를 조각.
3. 대표 결과 :
이 프로토콜의 주요 문제는 우리의 마지막 판독은 세포 죽음을 것입니다 특히 때문에, 건강한 소뇌 슬라이스 문화를 생성할 수 있도록합니다. 건강한 문화는 세포 몸 레이어는 투명 하나로 표시하고 현미경 (그림 1)에서 소뇌의 foliated 구조를 볼 수 있습니다. 문화의 몇 일 후에 조각이 얇고 비의 연결을 세포 시작은 조각의 가장자리로부터 멀리 마이 그 레이션 볼 수 있습니다. 문화의 몇 일 후에 조각 커버 어두운 원형 전지는 (대부분 macrophages), 결국 체외 (그림 2) 5 10-14일 후 번호 줄어 듭니다. 조각의 생존에 대한 궁극적인 증명은 Purkinje 세포와 같은 Calbindin 등 다양한 세포 마커에 대한 착색하는 것입니다. 그림 3은 몇 가지 TUNEL 긍정적인 핵으로 Purkinje 세포 층 대표 공촛점 현미경 이미지를 보여줍니다.
어떤 조각이 apoptotic 자극을받은 경우에도, 그들은 단 24 시간 동안 노출 있다고 생각하는 것이 중요합니다. 이것은 TUNEL의 얼룩과 죽어가는 세포의 DNA 조각을 관찰하기 위해 충분한 시간을 허용하지만 정의 Purkinje 세포 계층은 여전히 존재했다.
그림 1. DIV2에서 건강한 소뇌 슬라이스.이 이미지는 투명한 세포 몸 레이어와 건강 통에 foliated 소뇌 구조를 보여줍니다.
그림 2. DIV 7 건강 소뇌 슬라이스.이 그림에서 우리는 여전히 소뇌와 어두운 세포 기관의 모양의 foliated 구조를 볼 수 있습니다.
그림 3. 파 - 대우 소뇌 슬라이스의 대표 이미지는.이 공촛점 이미지 Calbindin (녹색) 및 TUNEL의 얼룩 (적색)에 대한 긍정적인 apoptotic 세포 물들일 Purkinje 세포를 보여줍니다. Purkinje 세포는 하나의 연속으로 표시되지 않지만 folium 같은 구조를 형성 클러스터 있습니다.
Discussion
이 방법의 연결 organotypic 문화의 여러 가지 응용 프로그램 중 하나를 설명하고 그것은 우리가 야생 유형 및 돌연변이 소뇌 조각에서 apoptotic 자극의 효과를 연구하기 위해 수 있습니다.
본 실험의 가장 중요한 부분은 지속적으로 건강 소뇌 슬라이스 문화를 생성할 수 있도록합니다. 핵심 요소는 해부하고 깔끔히 기술과 가능한 최소 시간에 프로토콜을 수행할 수있는 능력이 있지만, 동시에 신중하면 조각을 손상하지 않습니다. 또 다른 중요한 요인은 문화 미디어의 준비 및 구성이며, 이러한 문화는 매우 민감합니다, 그래서 우리는 미디어의 여러 조리법과 브랜드를 테스트했습니다. 혈청 또는 미디어의 다른 구성 요소도 다른 배치는 조각의 생존에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 Invitrogen 롯 # 480116에서 호스의 세럼과 함께 최상의 결과가 나왔어요.
소뇌 슬라이스가 생성되면 하나는 소뇌 개발, 전기 생리학, 세포 생존 혼자 또는 apoptotic 자극, excitotoxicity 또는 산소가 결핍되어서에 대한 응답으로 공부를하실 수 있습니다. 야생 타입과 돌연변이 소뇌 조각을 사용하여 비교 연구는 소뇌 기능과 개발의 여러 측면에서 매우 통찰력이있다.
Disclosures
진행 모든 동물의 작업은 IACUC에 의해 설립 정책에 따라 이루어졌다. 솔크 연구소는 AAALAC 인증 시설입니다.
Acknowledgments
이 연구는 입슨 재단에 의해 일부 자금했다. IMV는 분자 생물학의 미국 암 협회 교수이며, 모범적인 생명 과학의 어윈 제이콥스와 조안의 의자를 보유하고 있습니다. 이 작품은 NIH, Leducq 재단 Meriaux 재단 엘리슨 의료 재단 입슨 / Biomeasure, Sanofi Aventis, 전립선 암 재단과 HN과 프랜시스 C. 버거 재단의 보조금에 의해 일부 지원되었다. PAS은 신경 과학 및 약물 남용 (R01 DA019022)에있는 국립 연구소에 대한 맥나이트 엔다우먼트 기금 후원됩니다. 저자 마크 슈미트 감사하고 싶습니다. 그래픽 아트는 제이미 T. 사이먼에 의해 디자인되었다. 스폰서가 친절하게 Invitrogen에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Superglue | Krazy Glue | ||
| 6 well / 24 well cell culture plates | Corning | 3506/ 3527 | |
| 30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Biosciences | 554254 | |
| In situ cell death detection kit, TMR red | Roche Group | 12 156 792 910 | |
| Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | |
| Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen | A-11008 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Vibratome | Leica Microsystems | ||
| Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).
