Summary
这种方法描述了一代器官小脑文化和不同的小脑细胞类型的可行性某些凋亡刺激的效果。
Abstract
神经组织器官型文化是首次推出由霍格在1947年1,2，已经构成了一个在神经科学领域的重大突破。自那时以来，该技术进一步发展，目前有许多不同的方法来准备器官的文化。这里介绍的方法Stoppini 等描述的适应。片的准备和Gogolla等 。染色过程 3,4 。
这种技术的一个独特功能是它可以让你来研究大脑不同部位如海马或小脑在其原有的结构，提供了分离的文化，所有的细胞组织和神经网络被破坏的一大优势。在小脑的情况下，更是有利的，因为它允许浦肯野细胞的研究，极难获得分离的原代培养。这种方法可用于研究小脑在体外的某些发展特点，以及在野生型和突变小鼠的电生理和药理实验。
这里介绍的方法的目的是要研究，如Fas在发展中国家小脑配体的凋亡刺激的影响，采用TUNEL染色测定细胞凋亡。如果TUNEL染色细胞类型的特定标记，如Calbindin，浦肯野细胞相结合，这是可能的单元格中的特定人群的方式来评价细胞死亡。 Calbindin染色也是评估小脑文化素质的目的。
Protocol
1。器官型小脑文化：
- 成功生成器官小脑文化使用P0 - P3或P8 - P12之间的小鼠。对于我们的实验中，我们用小鼠在P8 - P12范围内，因为这个发展阶段，我们的研究更合适。
- 准备剥离和培养基：
- 脑解剖和切片准备进行低钠人工脑脊液中含有1mm的氯化钙（学联），10mm的D -葡萄糖，氯化钾4MM，5MM氯化镁，碳酸氢钠26MM，246mM蔗糖和酚红溶液（1:1000） ，pH值7.3。消毒的解决方案，通过0.22微米的过滤器和储存过滤器，在4 ° C。
- 小脑切片培养的最低限度的基本中鹰（MEM），25％热灭活马血清，25毫米的HEPES，1mm的谷氨酰胺，5毫克/毫升的葡萄糖，青霉素（100 U /毫升）和链霉素（100 U / mL）的75％。最多两个星期，通过0.22微米的过滤器和储存在4 ° C过滤介质。
- 解剖冰冷学联以前Carbogen（95％氧气和5％的二氧化碳）注起泡介质的大脑，即饱和与Carbogen将改变溶液的pH值，所以它会转移从红色到橙色。剥离应执行的最短的时间内，小心不要损伤大脑结构的可能。
- 在400微米，使用一个vibratome矢状部分的大脑切片。
- 用刀片在一个半球矢状切，试图削减小脑尽可能少，这将提供一个平坦的表面为切片。皮质仅用于支持，使切片更加容易，但因为时间是一个重要的问题是更方便的用刀片切出的皮质延髓的一半。
- 使用氰基丙烯酸酯（强力胶）的金属vibratome板固定在大脑的位置。这是很重要的寒意之前加入胶水冰板，并用管的一角，形成一层很薄的粘接层传播。如果有过量的强力胶，它会从板块分离时，在接触与学联和样品将丢失。
- 一旦连接到大脑vibratome板，补充足够的学联媒体，包括大脑，并把下面的冰板，以保持它的冷。
- 切割400微米的薄片，并转移他们用塑料巴斯德吸管（切的提示，以扩大它和避免损坏切片）6孔细胞培养板，含冰学联。
- 小脑两个胰岛素注射器，在解剖显微镜下（与小直径28 -表针的注射器）的帮助下从脑的其余部分分开。有些片将有强力胶的边缘：这是时刻试图删除它，因为它可以影响切片的可行性。重要的是没有仔细损害小脑结构。
- 小脑切片传送含0.4微米毛孔，30毫米培养板插入到6孔板。添加1毫升培养基，每孔，预先空调至少2个小时孵化在37 ° C和5％的CO 2（在细胞培养孵化器） 。放置在顶部的媒体，确保被困于车底有没有空气气泡，然后放在确保它们完全伸展的插入，没有液体覆盖它们的顶部和小脑片（每插入1-3）插入。媒体如有必要，吸干多余的。在37 ° C和5％的CO 2改变培养基，每2天或3天。最好是更换一次只有一个中期的部分（如半卷），因为使用的媒介包含片衍生的营养细胞存活的重要因素。
2。 Fas的治疗和小脑切片染色：
- 对于凋亡的挑战实验中，我们首先培养5天，改变在体外3（DIV3）天的媒体片。 DIV5文化直接将它添加到媒体，以媒体的变化，因为有一个干净的背景细胞死亡，0.5微克/毫升的Fas受体激动剂抗体JO2处理可以诱发一些在文化的死亡率。井有一半是未经处理作为对照组。
- 24小时后删除下方插入吸媒体。要修复的切片，冰冷的4％PFA下方添加1毫升1毫升以上的插入。孵育10分钟，在室温。
- 10分钟后取出的煤灰，用冷PBS简要。
- 接下来删除PBS和添加1毫升下方和1 mL，在室温下5分钟以上的20％冰冷的PBS孵育甲醇插入。
- 用PBS洗一遍，并添加1毫升下方和1毫升通透的0.5％TRITON - X - 100的PBS中插入以上。孵育至少12小时在4 ° C。
- 通透后，块的最低为20％BSA的PBS4小时在室温或4℃过夜° C。在这个阶段，片，可以保持在至少3天在4 ° C封闭液
- 为了染色片仔细切一块膜插入连接小脑切片，并将其转移到24孔板中含有PBS。
- 免疫是按顺序执行，先用TUNEL试剂一小时，然后Calbidin抗体过夜。
- 吸出PBS和关闭TUNEL法检测试剂添加到250μL，每口井，确保它涵盖了整个表面的切片。在37 ° C孵育一小时在黑暗中。
- 一个小时后删除TUNEL法混合10分钟，用PBS洗三次。
- 最后一次洗涤后，去除PBS，并添加250μL的PBS Calbindin抗体的1 / 1000稀释，孵育4℃过夜° C黑暗环境中。
- 删除主抗体溶液和10分钟，用PBS洗三次。
- 加入250μL二次抗体稀释在PBS孵育室温在黑暗中至少有三个小时的1 / 500。我们用TUNEL试剂盒是TMR的红色标记，因此我们Calbindin二次抗体结合的Alexa网站- 488。
- 10分钟，用PBS洗三次，并安装到使用安装媒体包含的DAPI玻璃显微镜幻灯片片。
- 图像分别使用488 nm和561 nm的激发Calbindin和TUNEL wavelenght共聚焦显微镜切片。
3。代表性的成果：
此协议的主要挑战是能够生成健康的小脑切片文化，尤其是因为我们的最终读数将细胞死亡。健康的文化作为一个细胞体层是半透明的出现，可以让你看到叶片状结构，在显微镜下（图1）小脑。经过几天的文化切片薄和非神经细胞开始迁移片的边缘，可以观察。黑暗的圆形细胞（最有可能的巨噬细胞），盖片，经过几天的文化，最终将减少在后10-14天在体外（ 图 2 ）5。切片的可行性，最终证明是不同的细胞标记，如Calbindin，Purkinje细胞染色。图3显示了几个TUNEL阳性细胞核的浦肯野细胞层的代表共聚焦显微镜图像。
重要的是要考虑，即使收到一些切片细胞凋亡的刺激，他们只有24小时的暴露。这允许足够的时间来观察DNA片段，TUNEL染色的细胞死亡，但仍然存在一个定义的浦肯野细胞层。
图1。健康的DIV2小脑分一杯羹。，该图像显示的半透明细胞体层和面理化健康切片小脑结构。
图2。健康的小脑切片格7。在这个图片中，我们仍然可以观察小脑和黑暗的牢房机构的外观面理化结构。
图3。一个FAS治疗小脑切片的形象代表。，这共聚焦图像显示的浦肯野细胞Calbindin（绿色）和阳性细胞凋亡TUNEL染色（红色）的染色。浦肯野细胞不会出现在一个行，但都聚集形成一个薄层状结构。
Discussion
这种方法描述的神经器官文化的许多可能的应用之一，它使我们能够研究在野生型和突变型的小脑切片凋亡刺激的效果。
这个实验的最关键部分是能够始终如一地产生健康的小脑切片文化。关键因素是解剖和切片技术和能力履行该协议可能在最短时间内，但在同一时间，小心不要损坏切片。另一个关键因素是编制和培养基的成分，这些文化都非常敏感，所以我们来测试多个配方以及媒体的品牌。即使不同批次的血清或任何其他组件的媒体可能会影响切片的可行性。我们得到了最好的结果与马血清自Invitrogen批号480116。
一旦产生小脑切片，可以研究小脑的发展，电，单靠细胞存活或凋亡刺激，兴奋性毒性或缺氧。使用野生型和突变型的小脑切片的比较研究已经非常有见地的小脑的功能和发展的许多方面。
Disclosures
所有动物进行的工作是按照IACUC成立的政策。索尔克研究所的一个AAALAC认证认可设施。
Acknowledgments
这项研究是由先灵基金会的部分资助。秋意是美国癌症分子生物学学会教授，并拥有欧文和琼主席雅各布模范生命科学。这项工作是支持部分由美国国立卫生研究院，Leducq基金会，Meriaux基金会，埃利森医学基金会，易普森/ Biomeasure，赛诺菲安万特，前列腺癌基金会，和HN和弗朗西斯C.伯杰基金会的赠款。首席助理秘书长是由神经科学与药物滥用（R01 DA019022）国立麦克奈特捐赠基金。作者要感谢马克施密特。图形艺术设计由Jamie T.西蒙请Invitrogen公司提供赞助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Superglue | Krazy Glue | ||
| 6 well / 24 well cell culture plates | Corning | 3506/ 3527 | |
| 30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Biosciences | 554254 | |
| In situ cell death detection kit, TMR red | Roche Group | 12 156 792 910 | |
| Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | |
| Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen | A-11008 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Vibratome | Leica Microsystems | ||
| Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).
