Summary
Cette méthode décrit la génération de cultures organotypiques cérébelleux et l'effet de certains stimuli apoptotiques sur la viabilité des différents types de cellules du cervelet.
Abstract
Cultures organotypiques de tissu neuronal ont d'abord été introduite par Hogue en 1947 1,2 et ont constitué une percée majeure dans le domaine des neurosciences. Depuis lors, la technique a été développée et actuellement il ya de nombreuses façons de préparer des cultures organotypiques. La méthode présentée ici a été adaptée de celle décrite par Stoppini et al. Pour la préparation des tranches et de Gogolla et al. Pour la procédure de 3,4 coloration.
Une caractéristique unique de cette technique est qu'elle vous permet d'étudier les différentes parties du cerveau comme l'hippocampe ou du cervelet dans leur structure d'origine, offrant un gros avantage sur les cultures dissociées dans laquelle toute l'organisation cellulaire et les réseaux neuronaux sont perturbés. Dans le cas du cervelet, il est encore plus avantageuse car elle permet l'étude des cellules de Purkinje, extrêmement difficile d'obtenir que la culture principale dissociées. Cette méthode peut être utilisée pour étudier certaines caractéristiques développementales du cervelet in vitro, ainsi que pour des expériences électrophysiologiques et pharmacologiques dans les deux de type sauvage et des souris mutantes.
La méthode décrite ici a été conçu pour étudier l'effet de stimuli apoptotiques tels que Fas ligand dans le cervelet en développement, utilisant une coloration TUNEL pour mesurer la mort cellulaire par apoptose. Si coloration TUNEL est combiné avec des marqueurs type de cellule spécifique, comme pour les cellules de Purkinje calbindine, il est possible d'évaluer la mort cellulaire d'une manière population cellulaire spécifique. La coloration calbindine sert aussi le but d'évaluer la qualité des cultures du cervelet.
Protocol
1. Cultures organotypiques cérébelleuse:
- Pour réussir à produire des cultures organotypiques cérébelleuse utiliser des souris entre P0-P3 ou P8-P12. Pour notre expérience, nous avons utilisé des souris de la gamme P8-P12 parce que ce stade de développement était plus approprié pour notre étude.
- Préparer la dissection et le milieu de culture:
- La dissection du cerveau et de préparation de tranches sont réalisées dans artificielle de sodium liquide céphalo-bas (ACSF) contenant du chlorure de calcium 1 mM, 10 mM D-glucose, 4mm chlorure de potassium, chlorure de magnésium 5 mM, du bicarbonate de sodium 26mm, 246mm de saccharose et le phénol solution rouge (1:1000) , pH 7,3. Pour stériliser la solution, elle filtre à travers un filtre 0,22 um et stocker à 4 ° C.
- Tranches du cervelet sont cultivées dans 75% minimum Essential Medium Eagle (MEM), 25% de sérum de cheval inactivé à la chaleur, HEPES 25 mM, 1 mM de glutamine, 5mg / ml de glucose, la pénicilline (100 U / ml) et streptomycine (100 UI / ml). Filtrer le support à travers un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C pour un maximum de deux semaines.
- Disséquer cerveau dans glacée ACSF moyennes préalablement à barboter avec carbogène (95% d'oxygène et de dioxyde de carbone de 5%) Notez que la saturation avec Carbogen va changer le pH de la solution de sorte qu'il passera du rouge à l'orange. La dissection doit être effectuée dans le minimum de temps possible en faisant attention à ne pas endommager la structure du cerveau.
- Trancher le cerveau dans des coupes sagittales de 400 um en utilisant un vibratome.
- Faites une coupe sagittale avec une lame de rasoir dans un hémisphère, en essayant de couper aussi peu que possible du cervelet, ce qui donnera une surface plane pour le tranchage. Le cortex est utilisé uniquement pour le soutien pour faire le découpage plus facile, mais puisque le temps est une question importante qu'il est plus commode de couper la moitié rostrale du cortex avec une lame de rasoir.
- Utilisez cyanoacrylate (superglue) pour fixer la position du cerveau sur la plaque de métal vibratome. Il est important de refroidir la plaque sur la glace avant d'ajouter la colle et à le répandre ainsi l'aide de l'extrémité du tube pour former une couche de colle mince. Si il ya un excès de superglue, il va se détacher de la plaque quand il entre en contact avec l'ACSF et l'échantillon sera perdu.
- Une fois que le cerveau est attaché à la plaque vibratome, ajouter suffisamment de supports ACSF pour couvrir le cerveau et mettre de la glace en dessous de la plaque pour le garder froid.
- Couper les tranches 400 um et de les transférer à une pipette Pasteur en plastique (couper la pointe de l'élargir et d'éviter d'endommager les tranches) pour une plaque de 6 puits de culture cellulaire contenant ACSF sur la glace.
- Séparez le cervelet du reste du cerveau avec l'aide de deux seringues à insuline (seringues avec petit diamètre de 28 aiguilles de calibre) sous la loupe binoculaire. Certaines tranches aura Superglue fixés sur les bords: c'est le moment d'essayer de l'enlever car il peut affecter la viabilité de la tranche. Il est important de le faire avec soin, sans endommager la structure du cervelet.
- Transférer les tranches de cervelet de plaques de 6 puits contenant 30mm inserts plaque de culture avec 0,4 um pores. Ajouter 1 mL de milieu de culture par puits, qui a été pré-conditionnée par incubation pendant au moins 2 heures à 37 ° C et 5% de CO 2 (dans la incubateur de culture cellulaire). Placer les inserts sur le dessus du support en vous assurant qu'il n'ya pas de bulles d'air piégées en dessous et puis placer les tranches de cervelet (1-3 par plaquette) sur le dessus des inserts en s'assurant qu'ils sont en pleine extension et qu'aucun liquide n'est en les couvrant. Aspirer l'excès des médias, si nécessaire. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 change le milieu de culture tous les 2 ou 3 jours. Il est préférable de ne remplacer qu'une partie du milieu (par exemple ½ volume) à la fois, puisque milieu utilisé contient des facteurs trophiques tranche de dérivés qui sont importantes pour la survie cellulaire.
2. Traitement de Fas et de coloration des tranches du cervelet:
- Pour l'expérience du challenge apoptotiques, nous les tranches première culture pendant 5 jours médiatique en pleine mutation, le jour in vitro de 3 (DIV3). Sur DIV5 cultures sont traitées avec 0,5 pg / ml d'anticorps de l'Jo2 Fas agoniste en l'ajoutant directement aux médias dans le but d'avoir un fond propre de la mort cellulaire depuis les changements de médias peuvent induire une certaine mortalité dans les cultures. La moitié des puits ne sont pas traitées comme témoins.
- Après 24 heures retirer le support sous le inserts par aspiration. Pour fixer les tranches, ajouter 1 ml de glace froide PFA 4% en dessous et 1 ml dessus de l'insert. Incuber 10 minutes à température ambiante.
- Après 10 minutes retirer le PFA et laver rapidement avec du PBS froid.
- Ensuite enlevez le PBS et ajouter 1 ml et en dessous de 1 mL au-dessus de l'insert de 20% du méthanol glacé dans le PBS et incuber pendant 5 minutes à température ambiante.
- Laver à nouveau avec du PBS et ajouter 1 mL dessous et 1 ml dessus de l'insert de 0,5% de Triton-X-100 dans du PBS pour la perméabilisation. Incuber pendant un minimum de 12 heures à 4 ° C.
- Après perméabilisation, bloc avec 20% de BSA dans du PBS pour un minimum de4 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C. A ce stade, les tranches peuvent être conservés dans une solution de blocage d'au moins 3 jours à 4 ° C.
- Afin de colorer les tranches soigneusement découpé le morceau de la membrane d'insérer attaché à la tranche du cervelet et le transférer à des plaques 24 puits contenant du PBS.
- L'immunomarquage est réalisé de manière séquentielle, d'abord avec le réactif TUNEL pendant une heure et ensuite avec l'anticorps Calbidin nuit.
- Aspirer le PBS et ajouter 250 uL hors réactif TUNEL dans chaque puits de s'assurer qu'il couvre toute la surface de la tranche. Incuber à 37 ° C pendant une heure dans l'obscurité.
- Après une heure retirer le mélange TUNEL et laver avec du PBS à trois reprises pendant 10 minutes.
- Après le dernier lavage, retirez le PBS et ajouter 250 ul d'une dilution de 1 / 1000 de l'anticorps calbindine dans du PBS et incuber une nuit à 4 ° C dans l'obscurité.
- Retirer la solution d'anticorps primaire et laver avec du PBS à trois reprises pendant 10 minutes.
- Ajouter 250 ul d'anticorps secondaire dilué au 1 / 500 en PBS et laisser incuber pendant au moins trois heures à température ambiante dans l'obscurité. Le kit de TUNEL, nous avons utilisé est étiqueté avec TMR rouge, donc notre anticorps secondaire pour calbindine est conjugué à Alexa-488.
- Laver trois fois pendant 10 minutes avec du PBS et monter les tranches sur une lame de microscope en verre en utilisant un média de montage qui contient DAPI.
- Les tranches d'image avec un microscope confocal en utilisant les 488 nm longueur d'onde d'excitation et 561 nm pour calbindine et TUNEL respectivement.
3. Les résultats représentatifs:
Le principal défi de ce protocole est d'être capable de générer des cultures saines tranche de cervelet, surtout depuis que notre lecture finale sera la mort cellulaire. Une saine culture apparaît comme l'un où la couche de cellules du corps est translucide et vous permet de voir la structure en feuillets du cervelet sous le microscope (figure 1). Après quelques jours dans la culture des tranches de commencer à cellules minces et non-neuronales peuvent être observés migrer loin de la marge de la tranche. Les cellules rondes sombre (la plupart des macrophages probable) qui couvrent les tranches après quelques jours de culture, finira par diminuer en nombre après 10-14 jours in vitro (figure 2) 5. La preuve ultime de la viabilité des tranches est de coloration pour les différents marqueurs cellulaires, telles que calbindine pour les cellules de Purkinje. La figure 3 montre une image au microscope confocal à représentatifs de la couche de cellules de Purkinje avec plusieurs noyaux TUNEL positif.
Il est important de considérer que même si certaines tranches reçu un stimulus apoptotique, elles étaient seulement exposés pendant 24 heures. Cela a permis de suffisamment de temps pour observer la fragmentation de l'ADN dans les cellules de mourir avec la coloration TUNEL, mais une couche de cellules de Purkinje défini était encore présent.
Figure 1. Healthy tranche de cervelet au DIV2. Cette image montre la couche de cellules translucides corps et la structure en feuillets du cervelet dans une tranche saine.
Figure 2. Healthy tranche de cervelet au DIV 7. Dans cette image on peut encore observer la structure feuilletée du cervelet et de l'apparence des organes de cellule sombre.
Figure 3. Représentant l'image d'une tranche de Fas-traitée cérébelleux. Cette image confocale montre les cellules de Purkinje colorés avec calbindine (vert) et les cellules apoptotiques positifs pour la coloration TUNEL (rouge). Les cellules de Purkinje ne semblent pas en une seule rangée, mais sont regroupés en formant une structure ressemblant à folium.
Discussion
Cette méthode décrit l'une des nombreuses applications possibles des cultures organotypiques neuronale et il nous a permis d'étudier l'effet de stimuli apoptotiques de type sauvage et mutant tranches cérébelleux.
La partie la plus critique de cette expérience est d'être capable de générer constamment de saines cultures tranche de cervelet. Les facteurs clés sont la dissection et la technique de tranchage et la capacité d'exécuter le protocole dans le moins de temps possible, mais en même temps, en faisant attention à ne pas endommager les tranches. Un autre facteur crucial est la préparation et la composition des milieux de culture, ces cultures sont très sensibles, alors nous avons dû tester plusieurs recettes et les marques de médias. Même les différents lots de sérum ou de tout autre composant du média pourrait affecter la viabilité des tranches. Nous avons obtenu les meilleurs résultats avec le sérum de cheval à partir du lot # 480116 Invitrogen.
Une fois les tranches de cervelet sont générés, on peut étudier le développement du cervelet, de l'électrophysiologie, la survie cellulaire, seul ou en réponse à des stimuli apoptotiques, excitotoxicité ou la privation d'oxygène. Des études comparatives à l'aide de type sauvage et mutant tranches cérébelleuses ont été très perspicaces dans de nombreux aspects de la fonction cérébelleuse et le développement.
Disclosures
Tous les travaux menées sur des animaux a été effectué conformément aux politiques établies par le IACUC. Le Salk Institute est un centre accrédité AAALAC.
Acknowledgments
Cette étude a été financée en partie par la Fondation IPSEN. IMV est professeur American Cancer Society of Molecular Biology, et titulaire de la Chaire Irwin et Joan Jacobs en sciences de vie exemplaire. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du NIH, Leducq Foundation, Fondation Mériaux, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, et le HN et Frances C. Berger Foundation. Le PAS est financé par McKnight Fonds de dotation pour les neurosciences et le National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022). Les auteurs tiennent à remercier Mark Schmitt. Art graphique a été conçue par Jamie T. Simon. Parrainage a été aimablement fourni par Invitrogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Superglue | Krazy Glue | ||
| 6 well / 24 well cell culture plates | Corning | 3506/ 3527 | |
| 30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Biosciences | 554254 | |
| In situ cell death detection kit, TMR red | Roche Group | 12 156 792 910 | |
| Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | |
| Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen | A-11008 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Vibratome | Leica Microsystems | ||
| Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).
