Summary
このメソッドは、器官小脳文化の世代と異なる小脳の細胞型の生存率に一定のアポトーシス刺激の効果を説明します。
Abstract
神経組織の器官型培養物は、1947年1,2でホギュが導入され、神経科学の分野で大きなブレークスルーを構成している。それ以来、技術は、器官培養を準備するために多くの異なる方法があるさらに、現在は開発されました。ここで紹介する方法はStoppini らによって記述される1つから翻案されました。スライスの準備のためとGogolla らから。染色手順3,4のために。
このテクニックのユニークな特徴は、すべての細胞組織と神経回路網が中断されているの解離の文化上の大きな利点を提供し、あなたが彼らの元の構造の海馬や小脳などの脳の異なる部分を勉強できることです。それは解離初代培養として取得するにはプルキンエ細胞の研究は、極めて困難なことができるので小脳の場合には、さらに有利である。このメソッドは、in vitroで小脳の特定の発達の特徴を学ぶだけでなく、野生型と変異マウスの両方における電気生理学的および薬理学的実験のために使用することができます。
方法は、アポトーシス細胞死を測定するTUNEL染色を用いて、このような発展途上小脳におけるFasリガンドとしてのアポトーシス刺激の効果を研究するために設計されてここで説明する。 TUNEL染色は、プルキンエ細胞のためのようなカルビンジンような細胞型特異的なマーカーと組み合わせている場合、それは細胞集団特異的に細胞死を評価することが可能である。カルビンジン染色はまた小脳の文化の質を評価の目的を果たします。
Protocol
1。器官小脳文化：
- が正常に生成するために器官小脳培養は、P0〜P3やP8 - P12の間にマウスを使用してください。この発達段階は、我々の研究のためのより適切だったので私たちの実験のために我々は、P8 - P12の範囲でマウスを使用していました。
- 解剖と培養液を準備します。
- 脳の解剖やスライス標本を1mMの塩化カルシウムを含む低ナトリウム人工脳脊髄液（ACSF）、10mMのD -グルコース、4mmの塩化カリウム、5mMの塩化マグネシウム、26ミリメートル、重炭酸ナトリウム、246mMスクロースおよびフェノールレッド溶液（1:1000）で実施されています、pHは7.3。ソリューションを殺菌するために、4で0.22μmのフィルターとストアを介してフィルタ℃に
- 小脳スライスを75％最小必須培地イーグル（MEM）、25％熱不活化ウマ血清、25mMのHEPES、1mMのグルタミン、5mgの/ mLのグルコース、ペニシリン（100 U / mL）およびストレプトマイシン（100 U / mL）に培養されています。二週間、最大で4で0.22μmフィルターとストア° Cを介してメディアをフィルタします。
- それが赤からオレンジ色にシフトするので、以前にCarbogen（95％酸素、5％二酸化炭素）（注）でバブリング氷冷ACSF培地に脳を解剖し、Carbogenとその飽和は、溶液のpHを変更します。解剖は、脳の構造を損傷しないように注意しながら可能な限り最小限の時間で実行する必要があります。
- ビブラトームを用いて400μmの矢セクションで脳をスライスして。
- 小脳の可能な限り少ないカットしようとして、一方の半球にカミソリの刃と矢状切断してください、これはスライスのために平坦な表面を提供します。皮質は、スライスを簡単にするためにサポートのためにのみ使用されますが、時間が重要な問題であるため、それはかみそりの刃で皮質の吻側半分をカットする方が便利です。
- 金属のビブラトームプレートに脳の位置を固定する（スーパーグルー）シアノアクリレートを使用します。接着剤を追加する前に氷の上でプレートを冷却する為、薄い接着剤層を形成するためにチューブの先端を使用しても、それを広めることが重要です。スーパー接着剤の過剰がある場合はそれはACSFに接触し、サンプルが失われるとき、それはプレートから分離させます。
- 一度脳は、脳をカバーし、それが冷たい保つためにプレートの下に氷を置くのに十分なACSFのメディアを追加し、ビブラトームプレートに取り付けられています。
- 400μmのスライスをカットし、氷上でACSFを含む6ウェル細胞培養プレートにプラスチック製パスツールピペット（それを広げ、スライスへの損傷を避けるために、先端をカット）とそれらを転送する。
- 解剖顕微鏡未満のインスリンの注射器（小口径28ゲージの針付き注射器）の助けを借りて脳の残りの部分から小脳を区切ります。いくつかのスライスは、スーパー接着剤が端に接続されている必要があります：これは、スライスの存続に影響を与えることができるとして、それを削除しようとする瞬間です。小脳の構造を損なうことなく、慎重にそれをすることが重要です。
- 0.4μmの細孔と30ミリメートル培養プレートのインサートを含む6ウェルプレートに小脳スライスを転送する。 ℃、5％CO 2（細胞培養インキュベーター内）で37少なくとも2時間インキュベーションすることにより事前に調整されたウェル当たりの培地、1 mLを追加します。に気泡が下敷きにしないし、彼らが完全に引き出されているとは、液体がそれらをカバーしていないことを確認してインサートの上に小脳スライス（インサートあたり1-3）に配置されていることを確認してメディアの上に挿入して置きます。必要に応じて、メディアの過剰を吸引除去する。 37 ° C、5％CO 2培養液ごとに2日または3日を変更する。使用される培地は、細胞の生存にとって重要なスライス由来栄養因子を含んでいるので、それは、一度に培地の一部のみ（例えば½ボリューム）に置き換えるのがベストです。
2。小脳スライスのFas処理と染色：
- アポトーシスチャレンジ実験のため、我々第一文化試験管 3（DIV3） で一日でメディアを変更する5日間のスライス。 DIV5文化にメディアの変化は文化のいくつかの死亡を誘発することができるので、細胞死のきれいな背景を持つためにメディアに直接追加することによって、Fas抗体のアゴニスト抗体のJo2のの0.5μg/ mLで扱われます。井戸の半分は、コントロールとして未処理のままされています。
- 24時間後に吸引でインサートの下にメディアを取り外します。スライスを修正するには、下に氷冷4％PFAを1mLとインサート上に1 mLを加える。室温で10分間インキュベートする。
- 10分後にPFAを削除し、冷PBSでサッと洗う。
- 次のPBSを除去し、室温で5分間、PBSとインキュベートの20％氷冷メタノールのインサートの上に1mLの下に、1 mLを加える。
- 再びPBSで洗浄し、下に1 mlを添加し、透過性のためのPBS中の0.5％のインサートトリトン- X - 100上記の1 mLを。 4℃で12時間の最小インキュベート℃に
- 透過した後、最小のためにPBSで20％BSAでブロックする4室の温度で時間または4℃で一晩この段階でスライスを4で少なくとも3日間℃でブロッキング溶液で保存することができます
- スライスを染色するために、慎重に小脳スライスに接続されている挿入膜の一部をカットし、PBSを含む24ウェルプレートに移す。
- 免疫染色は一晩1時間TUNEL試薬で最初にしてCalbidinの抗体を用いて、順番に行われます。
- PBSを吸引除去し、各ウェルは、スライスの表面全体を確実に覆うことにTUNEL試薬から250μLを加える。暗所で一時間、37℃でインキュベートする。
- 一時間はTUNELミックスを削除し、10分間PBSで3回洗浄した後。
- 最後の洗浄後、PBSを除去し、PBSでカルビンジン抗体の1 / 1000希釈、250μLを追加し、4℃で一晩インキュベートします暗所で。
- 一次抗体溶液を除去し、10分間PBSで3回洗浄する。
- 暗所で室温で少なくとも3時間のためにPBSとインキュベートで1 / 500希釈した二次抗体250μLを加える。我々が使用TUNELキットはTMR赤で標識、従ってカルビンジンのための私たちの二次抗体はAlexa - 488に結合されるている。
- PBSで10分間3回洗浄し、DAPIを含むマウントメディアを使用してガラスの顕微鏡スライド上にスライスをマウントします。
- それぞれカルビンジンとTUNELのために488 nmの、561 nm励起wavelenghtを使用して共焦点顕微鏡と画像のスライスを。
3。代表的な結果：
このプロトコルの主な課題は、私たちの最終的な読み出しが細胞死となる、特に以来、健康な小脳スライス培養を生成できるようにすることです。健全な文化は、細胞体層は半透明なものとして表示され、顕微鏡（図1）下小脳の葉状構造を見ることができます。文化の数日後のスライスが薄いと非神経細胞に開始するが、スライスのマージンからの移行を観察することができます。文化の数日後のスライスをカバー暗い円形の細胞は（おそらくマクロファージ）、最終的にin vitroで 10〜14日（図2）5の後で数に減少します。スライスの生存のための究極の証拠は、このようなプルキンエ細胞のためのカルビンジンなど、さまざまな細胞マーカー、のために染色することです。図3は、いくつかのTUNEL陽性の核とプルキンエ細胞層の代表的な共焦点顕微鏡画像を示しています。
いくつかのスライスは、アポトーシス刺激を受けた場合であっても、それらは唯一の24時間暴露されたことを考慮することが重要です。これは、TUNEL染色による死細胞のDNA断片化を観察するのに十分な時間を使用できますが、定義されたプルキンエ細胞層は依然として存在していた。
図1。 DIV2で健康な小脳スライス。この画像半透明の細胞体層と健全なスライスの葉状小脳の構造を示しています。
図2。 DIV 7の健康な小脳スライス。この画像では、我々はまだ小脳と暗い細胞体の外観の葉状構造を観察することができます。
図3。 Fas抗体処理した小脳スライスの代表的なイメージが。この共焦点画像は、カルビンジン（緑）とTUNEL染色（赤）の陽性アポトーシス細胞で染色したプルキンエ細胞を示しています。プルキンエ細胞は、単一の行に表示されませんが、薄層のような構造を形成するクラスタ化されています。
Discussion
このメソッドは、神経器官の文化の多くの可能なアプリケーションの一つを説明し、それは、私たちは野生型と変異型脳切片におけるアポトーシス刺激の効果を検討することができました。
この実験の最も重要な部分は一貫して健康な小脳スライス培養を生成できるようにすることです。主な要因は、解剖やスライシング手法と可能な限り最短時間でプロトコルを実行する機能ですが、同時にスライスを傷つけないように気をつけながら。別の重大な要素は、培地の調製と組成物である、これらの文化は非常に敏感ですので、メディアのいくつかのレシピやブランドをテストしなければならなかった。血清またはメディアの他のコンポーネントのであっても別のバッチは、スライスの生存に影響を与える可能性があります。我々は、Invitrogenのロット＃480116からの馬の血清と最良の結果を得た。
小脳スライスが生成されると一小脳開発、電気生理学、単独でまたはアポトーシス刺激、興奮または酸素欠乏に応答して細胞の生存率を検討することができます。野生型と変異型小脳スライスを用いて比較研究は、小脳の機能と開発の多くの面で非常に洞察されている。
Disclosures
実施したすべての動物実験は、IACUCによって確立された方針に従って行われていた。ソーク研究所は、AAALAC認定施設です。
Acknowledgments
本研究では、イプセン財団によって一部で賄われていた。 IMVは、分子生物学のアメリカの癌協会の教授であり、そして典型的なライフサイエンスのアーウィンとジョーンジェイコブスチェアを保持しています。この作品は、NIH、Leducq財団、Meriaux財団、エリソン医学財団、イプセン/ Biomeasure、サノフィアベンティス、前立腺がん財団、およびHNとフランシスC. Bergerの財団からの補助金によって部分的にサポートされていました。 PASは、神経科学のためのマックナイト基金基金と薬物乱用（R01 DA019022）の国民の協会によって資金を供給される。著者はマークシュミットに感謝します。グラフィックアートはジェイミーT.サイモンによって設計されました。スポンサーが親切にInvitrogen社によって提供された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Superglue | Krazy Glue | ||
| 6 well / 24 well cell culture plates | Corning | 3506/ 3527 | |
| 30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Biosciences | 554254 | |
| In situ cell death detection kit, TMR red | Roche Group | 12 156 792 910 | |
| Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | |
| Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen | A-11008 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Vibratome | Leica Microsystems | ||
| Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).
