Summary
Denna metod beskriver generationen organotypic cerebellar kulturer och effekten av vissa apoptotiska stimuli på lönsamheten på olika lillhjärnan celltyper.
Abstract
Organotypic kulturer av neuronala vävnader infördes först genom Hogue 1947 1,2 och har utgjort ett stort genombrott inom området neurovetenskap. Sedan dess har tekniken utvecklats ytterligare och för närvarande finns många olika sätt att förbereda organotypic kulturer. Den metod som presenteras här har anpassats jämfört med beskrivningen av Stoppini et al. För beredning av skivor och från Gogolla et al. För färgningsproceduren 3,4.
Unikt för denna teknik är att det tillåter dig att studera olika delar av hjärnan såsom hippocampus och cerebellum i sin ursprungliga struktur, vilket ger en stor fördel över dissocierade kulturer där alla cellulära organisation och neurala nätverk störs. I fallet av lillhjärnan det är ännu mer fördelaktigt, eftersom den tillåter att studera Purkinje celler, mycket svårt att få så dissocierade primära kultur. Denna metod kan användas för att studera vissa utvecklings-funktioner i lillhjärnan in vitro, samt för elektrofysiologiska och farmakologiska experiment i både vildtyp och muterade möss.
Metoden som beskrivs här var utformad för att studera effekten av apoptotiska stimuli som Fas ligand i utvecklingsländerna lillhjärnan, med hjälp av Tunel färgning för att mäta apoptotisk celldöd. Om Tunel färgning kombineras med celltyp specifika markörer, såsom Calbindin för Purkinje celler är det möjligt att utvärdera celldöd i en cell population visst sätt. Den Calbindin färgning tjänar också syftet att utvärdera kvaliteten på lillhjärnan kulturer.
Protocol
1. Organotypic Cerebellar kulturer:
- För att framgångsrikt generera organotypic cerebellär kulturer använda möss mellan P0-P3 eller P8-P12. För vårt experiment använde vi möss i P8-P12 utbud eftersom det utvecklingsstadiet var mer lämpligt för vår studie.
- Förbered dissekering och odlingsmediet:
- Brain dissektion och skiva förberedelser sker i låg natriumhalt Konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) som innehåller 1mm kalciumklorid, 10mm D-glukos, 4mm kaliumklorid, 5mm magnesiumklorid, 26mm natriumbikarbonat, 246 mm sackaros och fenolrött lösning (1:1000) , pH 7,3. Att sterilisera lösningen, filtrera den genom ett 0,22 ìm filter och förvara vid 4 ° C.
- Cerebellär skivor odlas i 75% Minimum Essential Medium Eagle (MEM), 25% värmeinaktiveras häst serum, 25mm HEPES, 1mm glutamin, 5 mg / ml glukos, penicillin (100 U / ml) och streptomycin (100 U / ml). Filtrera mediet genom ett 0,22 ìm filter och förvara vid 4 ° C under högst två veckor.
- Dissekera hjärnan i iskallt ACSF medelstora tidigare bubblade med Carbogen (95% syre och 5% koldioxid) Observera, kommer att mättnad med Carbogen ändra pH i lösningen så att den kommer att skifta från rött till orange. Den dissektion bör utföras i den minsta möjliga tid att vara noga med att inte skada hjärnan struktur.
- Skiva hjärnan i sagittala avsnitt av 400 ìm med hjälp av en vibratome.
- Gör en sagittal skär med ett rakblad i en halvklotet, försöker skära så lite som möjligt av lillhjärnan, vilket kommer att ge en plan yta för skivning. Cortex används endast för stöd för att göra skivning lättare men eftersom tiden är en viktig fråga att det är mer praktiskt att skära ut rostralt halvan av hjärnbarken med ett rakblad.
- Använd cyanoakrylat (Superlim) för att fixera positionen i hjärnan på metall vibratome plattan. Det är viktigt att kyla plåten på is innan du lägger limmet och sprida det väl hjälp av spetsen på röret för att bilda ett tunt självhäftande skikt. Om det finns ett överskott av Superlim, kommer det att lossna från tallriken när det kommer i kontakt med ACSF och provet kommer att gå förlorade.
- När hjärnan är ansluten till vibratome plattan, tillsätt tillräckligt ACSF medierna att täcka hjärnan och lägga is under plattan för att hålla det kallt.
- Skär 400 ìm skivor och överföra dem med en plast pasteurpipett (cut spetsen för att bredda den och undvika skador på skivor) till en 6-och cellodling skylt som innehåller ACSF på is.
- Separera lillhjärnan från resten av hjärnan med hjälp av två insulinsprutor (sprutor med liten diameter 28-gauge nålar) under dissekera mikroskop. Vissa skivor kommer att ha Superlim fäst kanterna: detta är nu att försöka ta bort den eftersom det kan påverka lönsamheten i segmentet. Det är viktigt att göra det försiktigt utan att skada lillhjärnan struktur.
- Överför cerebellär skivor till 6-brunnars plattor med 30 mm skär kultur plattan med 0,4 ìm porer. Tillsätt 1 ml odlingssubstrat per brunn, som förbehandlats genom inkubering i minst 2 timmar vid 37 ° C och 5% CO 2 (i cellodling inkubatorn). Placera insatser på toppen av medierna och se till det inte finns några luftbubblor fångade under och sedan placera lillhjärnan skivor (1-3 per inlägg) ovanpå skären se till att de helt har utökats och att ingen vätska täcker dem. Aspirera överskott av media om det behövs. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 ändra närsubstrat var 2 eller 3 dagar. Det är bäst att ersätta en del av medium (t.ex. ½ volym) på en gång, sedan medium som används innehåller slice-derived trofiska faktorer som är viktiga för cellernas överlevnad.
2. Fas Behandling och färgning av Cerebellar Slices:
- För den apoptotiska utmaningen experimentet vi först kultur skivorna i 5 dagar byta media på dagen för in vitro-3 (DIV3). På DIV5 kulturer behandlas med 0,5 mikrogram / ml Fas agonist antikroppen Jo2 genom att lägga den direkt till media för att ha en ren bakgrund av celldöd sedan förändringarna i media kan medföra vissa dödligheten i de kulturer. Hälften av brunnarna lämnas obehandlade som kontroller.
- Efter 24 timmar tar bort media under skär genom undertryck. För att fixera skivor, tillsätt 1 ml iskall 4% PFA under och 1 ml över insatsen. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Efter 10 minuter bort PFA och Tvätta snabbt med kallt PBS.
- Nästa bort PBS och tillsätt 1 ml under och 1 ml över insatsen på 20% iskall metanol i PBS och inkubera 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta igen med PBS och tillsätt 1 ml under och 1 ml över insatsen på 0,5% Triton-X-100 i PBS för permeabilization. Inkubera i minst 12 timmar vid 4 ° C.
- Efter permeabilization, block med 20% BSA i PBS i minst4 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C. I detta skede skivor kan hållas i blockerande lösningen i minst 3 dygn vid 4 ° C.
- För att färga skivor försiktigt skära bit av membranet sätt knutna till lillhjärnan skiva och överföra den till 24-brunnars plattor med PBS.
- Den immunfärgning görs sekventiellt, först med Tunel reagens för en timme och sedan med Calbidin antikropp över natten.
- Aspirera PBS och tillsätt 250 mikroliter av Tunel reagens i varje brunn och kontrollera att den täcker hela ytan på skiva. Inkubera vid 37 ° C i en timme i mörker.
- Efter en timme bort Tunel blanda och tvätta med PBS tre gånger i 10 minuter.
- Efter den sista tvättningen, ta bort PBS och tillsätt 250 mikroliter av en 1 / 1000 utspädning av Calbindin antikroppar i PBS och inkubera över natten vid 4 ° C i mörker.
- Ta bort den primära antikroppen lösningen och tvätta med PBS tre gånger i 10 minuter.
- Tillsätt 250 mikroliter av sekundär antikropp utspädd 1 / 500 i PBS och inkubera i minst tre timmar vid rumstemperatur i mörker. Det Tunel kit som vi använde är märkt med TMR röd, alltså våra sekundära antikropp för Calbindin är konjugerad med Alexa-488.
- Tvätta tre gånger 10 minuter med PBS och montera skivor på ett glas objektsglas med en montering media som innehåller DAPI.
- Bild på skivor med ett konfokalmikroskop med 488 nm och 561 nm excitation våglängd för Calbindin och Tunel respektive.
3. Representativa resultat:
Den största utmaningen med detta protokoll är att kunna generera god lillhjärnan slice kulturer, särskilt eftersom vår sista avläsningen kommer att celldöd. En hälsosam kultur visas som en där cellkroppen lagret är genomskinligt och låter dig se folierade strukturen i lillhjärnan i mikroskop (Figur 1). Efter några dagar i kulturen skivor börjar tunna och icke-neuronala celler som kan observeras migrera bort från marginaler segmentet. Den mörka runda celler (troligen makrofager) som täcker skivorna efter några dagar i kulturen, så småningom kommer att minska i antal efter 10-14 dagar in vitro (Figur 2) 5. Det ultimata beviset för livskraft skivor är att färga för olika cellulära markörer, såsom Calbindin för Purkinje cellerna. Figur 3 visar ett representativt konfokalmikroskop bild av Purkinje cellager med flera Tunel positiva kärnor.
Det är viktigt att beakta att även om vissa skivor fått en apoptotiska stimulans, de var bara exponerad i 24 timmar. Detta gjorde tillräckligt med tid att observera DNA-fragmentering i den döende celler med Tunel färgning, men ett definierat Purkinje cellager var fortfarande närvarande.
Figur 1. Friska cerebellär bit på DIV2. Denna bild visar den genomskinliga lagret cellkroppen och folierade lillhjärnan strukturen i en frisk bit.
Figur 2. Friska cerebellär skiva på DIV 7. I denna bild vi fortfarande kan observera folierade struktur lillhjärnan och mörka cell organ.
Figur 3. Representativ bild av en Fas-behandlad cerebellär skiva. Detta konfokala Bilden visar Purkinje cellerna färgas med Calbindin (grön) och apoptotiska celler positiva för Tunel färgning (röd). Purkinje celler visas inte i en enda rad, men är grupperade bildar en folium-liknande struktur.
Discussion
Denna metod beskriver en av många möjliga tillämpningar av neuronala organotypic kulturer och det har vi kunnat studera effekten av apoptotiska stimuli i vildtyp och mutant cerebellär skivor.
Den mest kritiska delen av detta experiment är att kunna att konsekvent generera friska cerebellär slice kulturer. De viktigaste faktorerna är dissekering och skivning teknik och förmågan att utföra protokollet på minsta möjliga tid, men samtidigt var försiktig så du inte skadar skivorna. En annan avgörande faktor är att förbereda och sammansättning kulturmedia dessa kulturer är mycket känsliga, så vi fick testa flera recept och märken av media. Även olika partier av serum eller alla andra komponenter i media kan påverka lönsamheten i skivor. Vi fick det bästa resultatet med hästen Serum från Invitrogen Lot # 480.116.
När cerebellär skivor genereras man kan studera lillhjärnan utveckling, elektrofysiologi, cellöverlevnad ensam eller som svar på apoptotiska stimuli, excitotoxicity eller syrebrist. Jämförande studier med vildtyp och mutant cerebellär skivor har varit mycket insiktsfulla i många aspekter av lillhjärnans funktion och utveckling.
Disclosures
Alla animaliska arbete som utförs gjordes i enlighet med riktlinjer som fastställts av IACUC. Den Salk Institute är ett AAALAC ackrediterat anläggning.
Acknowledgments
Denna studie har finansierats delvis av Ipsen stiftelsen. IMV är en American Cancer Society professor i molekylärbiologi, och innehar Irwin och Joan Jacobs ordförande på ett föredömligt Life Sciences. Detta arbete stöddes delvis av anslag från NIH, Leducq Foundation, Meriaux stiftelsen, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, prostatacancer Foundation och HN och Frances C. Berger Stiftelsen. PAS är finansierat av McKnight Endowment fonden för neurovetenskap och National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022). Författarna vill tacka Mark Schmitt. Grafik ritades av Jamie T. Simon. Sponsring vänligt lämnades av Invitrogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Superglue | Krazy Glue | ||
| 6 well / 24 well cell culture plates | Corning | 3506/ 3527 | |
| 30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Biosciences | 554254 | |
| In situ cell death detection kit, TMR red | Roche Group | 12 156 792 910 | |
| Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | |
| Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen | A-11008 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Vibratome | Leica Microsystems | ||
| Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).
