Summary
Questo metodo descrive la generazione di organotipica culture cerebellare e l'effetto di alcuni stimoli apoptotici sulla vitalità dei diversi tipi di cellule del cervelletto.
Abstract
Culture organotipica del tessuto neuronale sono stati introdotti da Hogue nel 1947 1,2 e hanno costituito un importante passo avanti nel campo delle neuroscienze. Da allora, la tecnica è stata sviluppata ulteriormente e attualmente ci sono molti modi diversi per preparare culture organotipica. Il metodo presentato qui è stato adattato da quello descritto da Stoppini et al. Per la preparazione delle fette e da Gogolla et al. Per la procedura di colorazione 3,4.
Una caratteristica unica di questa tecnica è che permette di studiare diverse parti del cervello come l'ippocampo e cervelletto nella loro struttura originale, garantendo un grande vantaggio rispetto culture dissociato in cui sono sconvolto tutta l'organizzazione cellulare e reti neuronali. Nel caso del cervelletto è ancora più vantaggiosa perché consente lo studio delle cellule di Purkinje, estremamente difficili da ottenere come dissociata coltura principale. Questo metodo può essere utilizzato per studiare alcune caratteristiche dello sviluppo del cervelletto in vitro, come pure per studi elettrofisiologici e farmacologici, sia wild-type e topi mutanti.
Il metodo qui descritto è stato progettato per studiare l'effetto degli stimoli apoptotici, come ligando Fas nel cervelletto di sviluppo, utilizzando colorazione TUNEL per misurare la morte cellulare. Se la colorazione TUNEL è combinato con marcatori tipo di cellule specifiche, come calbindin per le cellule di Purkinje, è possibile valutare la morte cellulare in maniera specifica popolazione di cellule. La colorazione calbindin ha inoltre lo scopo di valutare la qualità delle culture del cervelletto.
Protocol
1. Organotipica Culture cerebellare:
- Per generare con successo organotipica culture cerebellare uso topi tra P0-P3 o P8-P12. Per il nostro esperimento abbiamo usato topi nel P8-P12 gamma perché questo stadio di sviluppo è stato più appropriato per il nostro studio.
- Preparare la dissezione e terreno di coltura:
- Dissezione del cervello e la preparazione fetta sono svolte in condizioni di scarsa artificiale di sodio liquido cerebrospinale (ACSF) contenente cloruro di calcio 1 mm, 10mM di D-glucosio, 4mm cloruro di potassio, cloruro di magnesio 5mm, 26mm bicarbonato di sodio, saccarosio e 246 mm rosso fenolo soluzione (1:1000) , pH 7.3. Per sterilizzare la soluzione, filtrare su filtro a 0,22 micron e conservare a 4 ° C.
- Fette cerebellari sono coltivate nel 75% minimo essenziale mezzo di Eagle (MEM), il 25% di siero siero di cavallo, HEPES 25mm, 1 mM glutammina, 5 mg / ml di glucosio, la penicillina (100 U / ml) e streptomicina (100 U / mL). Filtrare il mezzo attraverso un filtro a 0,22 micron e conservare a 4 ° C per un massimo di due settimane.
- Sezionare il cervello in gelide medio ACSF precedentemente bollito con Carbogen (95% di ossigeno e anidride carbonica del 5%) Si noti, che la saturazione con Carbogen cambierà il pH della soluzione in modo che si sposterà da rosso ad arancione. La dissezione deve essere eseguita nel minor tempo possibile facendo attenzione a non danneggiare la struttura del cervello.
- Tagliate il cervello in sezioni sagittali di 400 micron utilizzando un vibratome.
- Fare un taglio sagittale con una lametta in un emisfero, cercando di tagliare il meno possibile del cervelletto, ciò fornirà una superficie piana per affettare. La corteccia viene utilizzato solo per il supporto per rendere il taglio più facile, ma perché il tempo è una questione importante che è più conveniente tagliare la parte rostrale della corteccia con una lametta.
- Usa cianoacrilato (supercolla) per fissare la posizione del cervello sul piatto vibratome metallo. E 'importante per raffreddare la piastra sul ghiaccio prima di aggiungere la colla e di diffondere bene usando la punta del tubo per formare un sottile strato adesivo. Se c'è un eccesso di colla, si staccano dalla piastra quando viene a contatto con il ACSF e il campione sarà perso.
- Una volta che il cervello è attaccato alla piastra vibratome, aggiungere i media ACSF abbastanza per coprire il cervello e mettere il ghiaccio sotto la piastra per mantenerlo freddo.
- Tagliate le fette 400 micron e trasferirli con una pipetta Pasteur di plastica (tagliare la punta di ampliare ed evitare danni al fette) per un 6-pozzetti di coltura cellulare contenente ACSF sul ghiaccio.
- Separare il cervelletto dal resto del cervello con l'aiuto di due siringhe da insulina (siringhe di piccolo diametro 28-gauge aghi) sotto il microscopio da dissezione. Alcune fette avrà supercolla attaccato ai bordi: questo è il momento di provare a rimuoverlo in quanto può influenzare la vitalità della fetta. E 'importante farlo con cura, senza danneggiare la struttura del cervelletto.
- Trasferire le fettine cerebellare a 6-pozzetti contenenti inserti di 30 millimetri piastra di coltura con 0,4 micron pori. Aggiungere 1 ml di terreni di coltura per pozzetto, che è stato condizionato dalla pre-incubazione per almeno 2 ore a 37 ° C e 5% di CO 2 (in colture cellulari incubatore). Posizionare gli inserti sulla parte superiore del supporto assicurandosi che non ci siano bolle d'aria intrappolate sotto e poi posto le fette cerebellare (1-3 per inserto) sulla parte superiore del inserti assicurandosi che siano completamente estesi e che nessun liquido li copre. Aspirare l'eccesso di mezzi di comunicazione, se necessario. Incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 modifica del mezzo di coltura ogni 2 o 3 giorni. È meglio sostituire solo una porzione del mezzo (ad esempio il volume ½) in una sola volta, dal momento che contiene mezzo utilizzato fetta derivati fattori trofici che sono importanti per la sopravvivenza delle cellule.
2. Fas trattamento e colorazione di sezioni cerebellare:
- Per l'esperimento sfida apoptotico, abbiamo prima cultura le fette per 5 giorni la sostituzione del supporto il giorno in vitro 3 (DIV3). Su DIV5 culture sono trattati con 0,5 mg / mL di anticorpi Jo2 Fas agonista aggiungendolo direttamente sul supporto in modo da avere uno sfondo pulito di morte cellulare in quanto i cambiamenti dei media possono indurre alcuni mortalità nelle culture. La metà dei pozzi sono lasciati non trattati come controlli.
- Dopo 24 ore togliere la carta sotto gli inserti di aspirazione. Per risolvere le fette, aggiungere 1 ml di ghiaccio freddo PFA 4% e 1 mL sotto sopra l'inserto. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo 10 minuti togliere il PFA e lavare brevemente con PBS freddo.
- Avanti rimuovere il PBS e aggiungere 1 sotto mL e 1 mL sopra l'inserto del 20% ghiacciata metanolo in PBS e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare nuovamente con PBS e aggiungere 1 mL e 1 mL sotto sopra l'inserto del 0,5% Triton X-100 in PBS per permeabilizzazione. Incubare per un minimo di 12 ore a 4 ° C.
- Dopo permeabilizzazione, blocco con il 20% di BSA in PBS per un minimo di4 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C. In questa fase le fette può essere conservato in soluzione di blocco per almeno 3 giorni a 4 ° C.
- Al fine di macchiare le fette tagliate con cura la parte della membrana inserto allegato alla fetta cerebellare e trasferirlo a 24-pozzetti contenenti PBS.
- L'immunocolorazione è fatta in modo sequenziale, prima con reagente TUNEL per un'ora e poi con l'anticorpo Calbidin durante la notte.
- Aspirare il PBS e aggiungere 250 microlitri off reagente TUNEL in ciascun pozzetto facendo attenzione che copre l'intera superficie della fetta. Incubare a 37 ° C per un'ora al buio.
- Dopo un'ora rimuovere il mix TUNEL e lavare con PBS per tre volte per 10 minuti.
- Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il PBS e aggiungere 250 microlitri di una diluizione 1 / 1000 della dell'anticorpo calbindin in PBS e incubare una notte a 4 ° C al buio.
- Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi e lavare con PBS per tre volte per 10 minuti.
- Aggiungere 250 microlitri di anticorpo secondario diluito 1 / 500 in PBS e incubare per almeno tre ore a temperatura ambiente al buio. Il kit TUNEL che abbiamo usato è etichettato con TMR rosso, quindi il nostro anticorpo secondario per calbindin è coniugato con Alexa-488.
- Lavare tre volte per 10 minuti con PBS e montare le fette su un vetrino di vetro con un altro supporto di montaggio che contiene DAPI.
- Immagine le fette con un microscopio confocale utilizzando il 488 nm e 561 nm lunghezza d'onda di eccitazione per calbindin e TUNEL, rispettivamente.
3. Rappresentante dei risultati:
La sfida principale di questo protocollo è quello di essere in grado di generare sano culture fetta cerebellare, soprattutto perché la nostra lettura finale sarà la morte delle cellule. Una sana cultura appare come quella in cui lo strato corpo cellulare è trasparente e permette di vedere la struttura lamellare del cervelletto al microscopio (Figura 1). Dopo pochi giorni di cultura le fette inizio alle cellule sottili e non-neuronali possono essere osservati migrare lontano dai margini della fetta. Le cellule tondo scuro (macrofagi più probabile) che coprono le fette dopo pochi giorni di cultura, alla fine diminuzione del numero dopo 10-14 giorni in vitro (Figura 2) 5. La prova finale per la vitalità delle fette è a macchia di differenti marcatori cellulari, come calbindin per le cellule di Purkinje. La figura 3 mostra un'immagine rappresentativa microscopio confocale dello strato di cellule di Purkinje con diversi nuclei TUNEL positivi.
E 'importante considerare che, anche se alcune fette ricevuto uno stimolo apoptotico, sono stati esposti solo per 24 ore. Questo ha permesso il tempo sufficiente per osservare la frammentazione del DNA nelle cellule morenti con la colorazione TUNEL, ma un determinato strato di cellule di Purkinje era ancora presente.
Figura 1. Sana fetta cerebellare a DIV2. Questa immagine mostra il corpo traslucido strato di cellule e la struttura lamellare cerebellare in una fetta sano.
Figura 2. Sana fetta cerebellare a DIV 7. In questa immagine possiamo ancora osservare la struttura lamellare del cervelletto e la comparsa di corpi cellulari buio.
Figura 3. Immagine rappresentativa di una fetta Fas trattati cerebellare. Confocale Questa immagine mostra le cellule di Purkinje colorate con calbindin (verde) e le cellule apoptotiche positivo per la colorazione TUNEL (rosso). Cellule di Purkinje non appaiono in una singola riga, ma sono raggruppati formando una struttura simile folium.
Discussion
Questo metodo descrive una delle molte applicazioni possibili di culture neuronali organotipica e ci ha permesso di studiare l'effetto degli stimoli apoptotici nel wild-type e mutanti fette cerebellare.
La parte più critica di questo esperimento è quello di essere in grado di generare costantemente sano culture fetta cerebellare. I fattori chiave sono la dissezione e la tecnica di taglio e la capacità di eseguire il protocollo nel minor tempo possibile, ma allo stesso tempo facendo attenzione a non danneggiare le fette. Un altro fattore cruciale è la preparazione e la composizione dei terreni di coltura, queste culture sono molto sensibili, quindi abbiamo dovuto provare diverse ricette e marche di supporti. Anche diversi lotti di siero o di altri componenti dei mass media possono influenzare la vitalità delle fette. Abbiamo ottenuto i migliori risultati con il siero di cavallo da Lot Invitrogen # 480116.
Una volta che le fette cerebellare si generano si può studiare lo sviluppo del cervelletto, elettrofisiologia, la sopravvivenza delle cellule da soli o in risposta a stimoli apoptotici, eccitotossicità o mancanza di ossigeno. Studi comparativi con wild-type e mutanti fette cerebellare sono stati molto perspicace in molti aspetti della funzione cerebellare e sviluppo.
Disclosures
Tutto il lavoro svolto animale è stato fatto in accordo con le politiche stabilite dal IACUC. L'Istituto Salk è una struttura AAALAC accreditati.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato in parte dalla Fondazione Ipsen. IMV è un americano Cancer Society Professore di Biologia Molecolare, ed è titolare della cattedra e Joan Irwin Jacobs in Scienze della vita esemplare. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti del NIH, Fondazione Leducq, Meriaux Fondazione, Ellison Medical Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostate Cancer Foundation, e la HN e Frances C. Berger Foundation. PAS è finanziato dal Fondo per McKnight Endowment Neuroscienze e il National Institute on Drug Abuse (R01 DA019022). Gli autori desiderano ringraziare Mark Schmitt. Grafica è stato progettato da Jamie T. Simon. Sponsorizzazione è stato gentilmente fornito da Invitrogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Superglue | Krazy Glue | ||
| 6 well / 24 well cell culture plates | Corning | 3506/ 3527 | |
| 30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Biosciences | 554254 | |
| In situ cell death detection kit, TMR red | Roche Group | 12 156 792 910 | |
| Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | |
| Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen | A-11008 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Vibratome | Leica Microsystems | ||
| Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).
