Summary
Este método descreve a geração de organotípicas culturas cerebelar eo efeito de determinados estímulos apoptóticos sobre a viabilidade de diferentes tipos de células do cerebelo.
Abstract
Organotípicas culturas de tecido neuronal foram introduzidas pela primeira vez em 1947 1,2 Hogue, que constituíram um grande avanço no campo da neurociência. Desde então, a técnica foi desenvolvida e, atualmente, existem muitas maneiras diferentes de preparar culturas organotípicas. O método apresentado aqui foi adaptada da descrita por Stoppini et al. Para a preparação das fatias e de Gogolla et al. Para o procedimento de coloração 3,4.
Uma característica exclusiva desta técnica é que ele permite que você estude as diferentes partes do cérebro, como hipocampo ou cerebelo em sua estrutura original, proporcionando uma grande vantagem sobre as culturas dissociadas em que toda a organização celular e redes neuronais são interrompidos. No caso do cerebelo é ainda mais vantajosa, pois permite o estudo das células de Purkinje, extremamente difícil de obter como cultura principal dissociados. Este método pode ser usado para estudar algumas características de desenvolvimento do cerebelo in vitro, bem como para experimentos eletrofisiológicos e farmacológicas, tanto do tipo selvagem e camundongos mutantes.
O método descrito aqui foi projetado para estudar o efeito dos estímulos apoptóticos, tais como ligante Fas no cerebelo em desenvolvimento, usando coloração TUNEL para medir a morte celular por apoptose. Se a coloração TUNEL é combinada com o tipo de marcadores celulares específicos, como calbindina de células de Purkinje, é possível avaliar a morte celular de uma forma população de células específicas. A coloração calbindina também serve o propósito de avaliar a qualidade das culturas de cerebelo.
Protocol
1. Organotípicas Culturas Cerebelar:
- Para conseguir gerar organotípicas culturas cerebelar usar mouses entre P0-P3 ou P8-P12. Para nosso experimento utilizamos ratos na faixa P8-P12, porque nesta fase de desenvolvimento era mais apropriado para o nosso estudo.
- Prepare a dissecção eo meio de cultura:
- Dissecção do cérebro e preparação fatia são realizados em baixa de sódio líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) contendo 1mM de cloreto de cálcio, 10mM D-Glicose, 4 mM de cloreto de potássio, cloreto de magnésio 5mM, bicarbonato de sódio 26mm, 246 mm de sacarose e solução de vermelho de fenol (1:1000) , pH 7,3. Para esterilizar a solução, filtrá-la através de um filtro 0,22 mm e armazenar a 4 ° C.
- Fatias cerebelar são cultivadas em 75% Mínimo Essencial Medium Eagle (MEM), soro de cavalo 25% inativado pelo calor, HEPES 25 mM, 1mM glutamina, 5mg / mL de glicose, penicilina (100 U / mL) e estreptomicina (100 U / mL). Filtrar o meio através de um filtro de 0,22 mm e armazenar a 4 ° C para um máximo de duas semanas.
- Dissecar o cérebro na gelada médio ACSF previamente aeradas com carbogênio (95% de oxigênio e dióxido de carbono de 5%) Note, que a saturação com carbogênio vai mudar o pH da solução para que ele irá mudar de vermelho para laranja. A dissecção deve ser realizado, no montante mínimo de tempo possível tomando cuidado para não danificar a estrutura do cérebro.
- Fatia do cérebro em cortes sagitais de 400 m usando uma vibratome.
- Faça um corte sagital com uma lâmina de barbear em um hemisfério, tentando cortar o mínimo possível do cerebelo, o que irá proporcionar uma superfície plana para corte. O córtex é apenas usado para apoio para fazer o corte mais fácil, mas como o tempo é uma questão importante, é mais conveniente para cortar a metade rostral do córtex com uma lâmina de barbear.
- Use cianoacrilato (Superglue) para fixar a posição do cérebro no prato vibratome metal. É importante para refrigerar a placa de gelo antes de adicionar a cola e espalhe bem com a ponta do tubo para formar uma camada adesiva fina. Se houver um excesso de Superglue, ele irá retirar do prato quando entra em contato com a ACSF ea amostra será perdido.
- Uma vez que o cérebro está ligado à placa vibratome, adicionar mídia o suficiente para cobrir ACSF o cérebro e colocar gelo abaixo da placa para mantê-lo frio.
- Cortar fatias 400 mm e transferi-los com um plástico Pasteur pipeta (cortar a ponta para alargá-la e evitar danos às fatias) para uma placa de cultura de 6 bem célula que contém ACSF no gelo.
- Separar o cerebelo do resto do cérebro com a ajuda de duas seringas de insulina (seringas com diâmetro pequeno calibre 28 agulhas) sob o microscópio de dissecação. Algumas fatias terá Superglue anexado às bordas: este é o momento para tentar removê-lo, pois ele pode afetar a viabilidade da fatia. É importante fazê-lo cuidadosamente sem danificar a estrutura do cerebelo.
- Transferir as fatias cerebelar a 6 bem-placas contendo insere placa 30 milímetros cultura com 0,4 mM poros. Adicionar 1 mL de meios de cultura por poço, que foi pré-condicionado por incubação por pelo menos 2 horas a 37 ° C e 5% CO 2 (na cultura de células incubadora). Coloque o insere no topo da mídia certificando-se que não há bolhas de ar presas debaixo e em seguida, coloque as fatias de cerebelo (1-3 por pastilha) em cima das inserções ter certeza que eles estão totalmente estendida, e que o líquido não está cobrindo-los. Aspirar o excesso de meios de comunicação, se necessário. Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 mudando o meio de cultura a cada 2 ou 3 dias. O melhor é substituir apenas uma parte do meio (por exemplo, volume de ½) de uma só vez, desde meio utilizado contém fatores fatia derivados tróficos que são importantes para a sobrevivência da célula.
2. Tratamento Fas e coloração das fatias Cerebelar:
- Para o experimento desafio apoptose, primeira cultura que as fatias por 5 dias em mudança de mídia no dia in vitro 3 (Div3). Em DIV5 culturas são tratadas com 0,5 mg / mL do anticorpo Jo2 Fas agonista, adicionando-o diretamente para a mídia, a fim de ter um fundo limpo de morte celular desde as mudanças dos meios de comunicação podem induzir alguma mortalidade nas culturas. Metade dos poços são deixados sem tratamento como controle.
- Após 24 horas remova a mídia sob as inserções por sucção. Para corrigir as fatias, adicione 1 mL de gelo frio PFA 4% abaixo e acima da 1 mL de inserção. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Após 10 minutos retire a PFA e lave brevemente com PBS frio.
- Em seguida remova o PBS e adicionar 1 mL por baixo e 1 mL acima da inserção de 20% de metanol gelado em PBS e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
- Lave novamente com PBS e adicionar 1 mL e 1 mL por baixo acima da inserção de 0,5% de 100 Triton-X em PBS para permeabilização. Incubar por um mínimo de 12 horas a 4 ° C.
- Depois de permeabilização, bloco com 20% BSA em PBS por um mínimo de4 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Nesta fase as fatias podem ser mantidos em solução de bloqueio por pelo menos 3 dias a 4 ° C.
- De modo a manchar as fatias de corte cuidadosamente o pedaço da membrana inserir anexado à fatia do cerebelo e transferi-la para placas de 24 poços contendo PBS.
- A imunocoloração é feito sequencialmente, primeiro com o reagente TUNEL por uma hora e, em seguida, com anticorpo Calbidin durante a noite.
- Aspirar o PBS e adicionar 250 mL de reagente off TUNEL em cada poço ter certeza que ele cobre toda a superfície da fatia. Incubar a 37 ° C por uma hora no escuro.
- Após uma hora retire a mistura TUNEL e lavar com PBS três vezes por 10 minutos.
- Após a última lavagem, remover o PBS e adicionar 250 mL de uma diluição 1 / 1000 do anticorpo calbindina em PBS e incubar overnight a 4 ° C no escuro.
- Remover a solução de anticorpo primário e lavar com PBS três vezes por 10 minutos.
- Adicionar mL 250 de anticorpo secundário diluído 1 / 500 em PBS e incubar por pelo menos três horas à temperatura ambiente no escuro. O kit TUNEL usamos é rotulado com TMR vermelho, pois o nosso anticorpo secundário para calbindina é conjugado com Alexa-488.
- Lavar três vezes por 10 minutos com PBS e monte as fatias em uma lâmina de vidro usando uma mídia de montagem que contém DAPI.
- Imagem as fatias com um microscópio confocal usando a 488 nm e 561 nm comprimento de onda de excitação para calbindina e TUNEL, respectivamente.
3. Resultados representativos:
O desafio principal deste protocolo deve ser capaz de gerar saudável culturas fatia cerebelar, especialmente desde a nossa leitura final será a morte celular. Uma cultura saudável aparece como aquele onde a camada de células do corpo é translúcido e permite que você veja a estrutura foliated do cerebelo sob o microscópio (Figura 1). Depois de alguns dias em cultura as fatias de começar a células finas e não-neuronal pode ser observado a migração para fora das margens da fatia. As células redondas escuras (mais provável macrófagos) que cobrem as fatias depois de alguns dias em cultura, acabará por diminuir em número após 10-14 dias in vitro (Figura 2) 5. A prova final para a viabilidade das fatias é a mancha para diferentes marcadores celulares, como calbindina para as células de Purkinje. A Figura 3 mostra uma imagem de microscópio confocal representante da camada de células de Purkinje com núcleos TUNEL várias positivo.
É importante considerar que, mesmo se algumas fatias recebeu um estímulo apoptótico, eles só foram expostas por 24 horas. Isto permitiu tempo suficiente para observar fragmentação do DNA nas células morrendo com a coloração TUNEL, mas uma camada de células Purkinje definido ainda estava presente.
Figura 1. Fatia cerebelar saudável em div2. Esta imagem mostra a camada de células do corpo translúcido ea estrutura foliated cerebelar em uma fatia saudável.
Figura 2. Fatia cerebelar saudável em DIV 7. Nesta imagem ainda podemos observar a estrutura foliated do cerebelo e do aparecimento de corpos celulares escuro.
Figura 3. Imagem representativa de uma fatia Fas-tratados cerebelar. Esta imagem confocal mostra as células Purkinje corados com calbindina (verde) e as células apoptóticas TUNEL positivas para a coloração (vermelho). Células de Purkinje não aparecem em uma única linha, mas estão agrupados formando uma estrutura folium-like.
Discussion
Este método descreve uma das muitas aplicações possíveis de culturas organotípicas neuronal e nos permitiu estudar o efeito dos estímulos apoptóticos no tipo selvagem e mutante fatias de cerebelo.
A parte mais crítica desta experiência é ser capaz de gerar consistentemente saudável culturas fatia cerebelar. Os factores chave são dissecção e técnica de corte e a capacidade de executar o protocolo no menor tempo possível, mas ao mesmo tempo, tomando cuidado para não danificar as fatias. Outro fator crucial é a preparação ea composição do meio de cultura, essas culturas são muito sensíveis, por isso tivemos de testar várias receitas e marcas de mídia. Mesmo diferentes lotes de soro ou quaisquer outros componentes dos meios de comunicação podem afetar a viabilidade das fatias. Nós temos os melhores resultados com o soro de cavalo de Invitrogen Lot # 480116.
Uma vez que as fatias de cerebelo são gerados pode-se estudar o desenvolvimento do cerebelo, eletrofisiologia, a sobrevivência da célula isolada ou em resposta a estímulos apoptóticos, excitotoxicidade ou privação de oxigênio. Estudos comparativos utilizando tipo selvagem e mutante fatias cerebelar foram muito perspicaz em muitos aspectos da função cerebelar e desenvolvimento.
Disclosures
Todo o trabalho foi feito com animais conduzidos de acordo com as políticas estabelecidas pelo IACUC. O Instituto Salk é uma facilidade AAALAC credenciados.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado em parte pela Fundação IPSEN. IMV é um Professor Sociedade Americana do Câncer da Biologia Molecular, e detém o Irwin Jacobs e Joan Presidente em Ciências da Vida Exemplar. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do NIH, Fundação Leducq, Fundação Meriaux, Medicina Ellison Foundation, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Câncer de Próstata Foundation, eo HN e Frances C. Berger Foundation. PAS é financiado pelo Fundo de Dotação McKnight de Neurociências e do Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (R01 DA019022). Os autores gostariam de agradecer a Mark Schmitt. Arte gráfica foi desenhada por Jamie T. Simon. Patrocínio foi gentilmente cedido pela Invitrogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050 | |
| Hepes | Invitrogen | 15630 | |
| Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| Superglue | Krazy Glue | ||
| 6 well / 24 well cell culture plates | Corning | 3506/ 3527 | |
| 30mm culture plate inserts (0.4-μm pore) | EMD Millipore | PICM03050 | |
| Purified NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2) | BD Biosciences | 554254 | |
| In situ cell death detection kit, TMR red | Roche Group | 12 156 792 910 | |
| Rabbit anti-Calbindin D-28k antibody | Swant | CB-38a | |
| Alexa 488-goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Invitrogen | A-11008 | |
| Vectashield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Vibratome | Leica Microsystems | ||
| Confocal Microscope | Leica Microsystems |
References
- Hogue, M. J. Human fetal ependymal cells in tissue cultures. Anat Rec. 99, 523-529 (1947).
- Hogue, M. J. Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures. Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).
