Summary
전통적인 핵산 quantitation 방법론을 실천하고 효율적인 대안으로 NanoDrop microvolume 시스템의 사용은 두 microvolume 핵산 quantitation 프로토콜의 시범을 통해 설명합니다.
Abstract
Biomolecular의 assays은 지속적으로 자주 microvolume의 quantitation를 수행할 수있는 사람들을 위해 핵산 quantitation에 대한 기존 쿠베트 기반 악기의 사용을 precluding, 재료의 점차 작은 금액을 사용하는 것이 개발되고있다.
NanoDrop microvolume 샘플 유지 시스템 (써모 사이 언티픽 NanoDrop 제품) 등 cuvettes이나 모세 혈관과 같은 전통적인 억제 장치의 독립적인 시료의 미세한을 캡처하고 유지하기 위해 광섬유 기술과 자연의 표면 장력 특성을 결합하여 기능을 수행합니다. 또한, 시스템은 본질적으로 dilutions을 수행하기 위해 필요가 없습니다. 짧은 경로 길이, 핵산 농도 측정의 광범위한 결과를, 고용 spectroscopic 분석에 필요한 샘플의 볼륨을 줄이면 또한, 많은 분자 흐름 전반에 걸쳐 추가적인 품질 관리 단계의 포함을 용이 효율성을 증가하고 궁극적으로 하류 결과에 큰 자신감을 선도.
제한된 질량 높은 감도 형광 분석을위한 필요는 또한 최근의 실험 발전과 함께 등장했습니다. 같은 microvolume 샘플 보존 기술을 사용하여 형광 측정은 형광 assays 볼륨 요구 사항이 대폭 줄일 수 있도록 재료의 2 μL을 수행할 수 있습니다. 10 μL 이하의 이러한 microreactions는 전용 microvolume의 fluorospectrometer를 사용하여 지금은 가능합니다.
두 microvolume 핵산 quantitation 프로토콜은 전통적인 쿠베트 기반 프로토콜에 실질적인 대안으로 통합 샘플 보존 시스템을 사용하는 것이 증명됩니다. 첫째, microvolume 분광 광도계를 사용하여 직접 A260 흡광도 방법을 설명합니다. 이 microvolume의 fluorospectrometer로 감소 볼륨 형광 반응을 사용할 수있는 형광 기반의 방법을 시범옵니다. 이 소설 기법은 1에서 PG / μL 시료의 최소한의 소비와 15,000 NG / μL까지 핵산 농도의 평가를 가능하게합니다.
Protocol
1. NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 핵산 부량
- 시작하려면 아래 광학 표면에 깨끗한 탈이온수 2 ~ 3 μL를 pipetting하여 microvolume 분광 광도계 샘플 유지 시스템의 위턱과 아래턱에 광학 표면을 청소하십시오.
- 상단 받침대는 탈이온수 접촉 들어오는 있도록, 레버 암을 닫습니다. 레버 암을 들어 깨끗하고, 건조, 보푸라기가없는 실험실 닦아와 함께 광학 표면을 모두 닦아.
- NanoDrop 소프트웨어를 열고 핵산 응용 프로그램을 선택합니다. 낮은 광학 표면에 버퍼 1 μL를 분배하여 빈 측정을 수행하는 작은 볼륨 보정 pipettor을 사용하십시오. 레버 암을 절감하고 핵산 응용 프로그램에서 "공백"을 선택하십시오.
- 일단 빈 측정이 완료되면, 깨끗하고, 건조, 보푸라기가없는 실험실 닦아와 함께 광학 표면 모두를 청소하십시오.
- 측정되어야하는 예제에 해당하는 상수를 선택합니다.
표 1. NanoDrop microvolume 분광 광도계, TrayCell microcell 쿠베트와 함께 사용 전통 쿠베트 기반 분광 광도계 및 PicoGreen 분석과 함께 microvolume의 NanoDrop의 fluorospectrometer를 사용하여 직접 A280 흡광도 측정에 대한 일반적인 핵산 농도 범위.샘플 유형 옵션 선택 농도를 계산하는 데 사용 상수 dsDNA DNA - 50 50 ssDNA DNA - 33 33 RNA RNA - 40 40 Oligo 사용자 정의 15-150 - 낮은 광학 받침대에 핵산 샘플의 1 μL를 분배하고 레버 암을 닫습니다. 측정 독립적인 볼륨이기 때문에 예제는 만들 수있는 측정을위한 두 광학 표면 사이의 격차에 다리를 놓으려고해야합니다.
- 어플 리케이션 소프트웨어에서 "법안"를 선택하십시오. 소프트웨어는 자동 핵산 농도 및 순도 비율을 계산합니다. 샘플 측정에 따라, 스펙트럼 출력을 검토합니다.
- 소프트웨어는 자동 핵산 농도 및 순도 비율을 계산합니다. 샘플 측정에 따라 샘플의 품질을 평가하기 위해 스펙트럼 이미지를 검토합니다.
- 전형적인 핵산 샘플은 매우 특징적인 프로필을 것입니다.
그림 1. 전형적인 핵산 샘플은 매우 독특한 프로필을 것입니다. - 특정 핵산 분리 기술과 관련된 오염 물질의 일반적인 소스는 페놀 / Trizol 및 열 추출을 포함합니다. 페놀 / Trizol 추출의 경우, 잔여 시약의 오염은 220-240 nm의 사이에 비정상적인 스펙트럼에 의해뿐만 아니라 260-280 nm의 영역에 교대로 표시됩니다. 반대로 열 추출에서 잔여 구아니딘 230 nm의 근처에 최대 230 nm의 약 240 nm의에 여물 변화에 기여할 수 있습니다.
그림 2. 샘플 B와 C의 봉우리와 골짜기에있는 교대는이 오염 물질은 핵산 샘플의 스펙트럼에 영향을 미칠 수있는 방법을 설명 샘플을 비교했다. - 정확하게 샘플의 품질을 평가하기 위해, 280분의 260 또는 230분의 260 비율이 전체 스펙트럼 품질와 함께 분석해야합니다. 순수한 핵산은 일반적으로 각각 ~ 1.8 280분의 260 비율과 DNA와 RNA에 대한 ~ 2.0 280분의 260 비율을 얻을 수 있습니다. 이 비율은 산도와 빈과 샘플 측정하기 위해 사용되는 버퍼의 이온 강도에 따라 좌우됩니다. 기본 솔루션이 0.2-0.3의 비율을 통해 - 대표되지만 산성 솔루션은 0.2-0.3의 비율을 세 이하 대표 것입니다. 크게 다른 순도 비율 280 nm의 또는 근처에 강하게 흡수 단백질, 페놀 또는 기타 오염 물질의 존재를 나타낼 수 있습니다. 230분의 260 순도 비율은 1.8-2.2의 범위에서 일반적으로 "순수"핵산의 산성에 대한 값으로 DNA 순도의 두 번째 측정하기위한 한 방법입니다. 예상 값보다 훨씬 낮은 순도의 비율이 사용되는 절연 기술 추가 최적화가 필요할 수 있습니다 나타낼 수 있습니다.
- NanoDrop spectrophotometers도 직접 흡광도를 사용하여 단백질이나 단백질 colorimetric assays로를 계량하는 데 사용할 수 있습니다. 적절한 열 형성과 재현성을 보장하기 위해, 2 μl 샘플은 단백질 샘플하시기 바랍니다. 다음 조브 비디오를 참조하십시오 NanoDrop 분광 사용 Microvolume 단백질 농도 결정 http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610을
- NanoDrop 3300을 사용하여 높은 감도 microvolume 핵산 quantitation을 발휘하려면 PicoGreen 형광 키트가 사용됩니다. 시작하려면, 상온에 키트 표준 및 모든 핵산 샘플을 평형. 형광 샘플 빛을 민감한 있으며 황색 또는 알루미늄 포장 튜브에 보관해야합니다.
- 필요하게 될 PicoGreen 작업 솔루션을뿐만 아니라 측정하는 모든 표준 및 샘플에 대한 충분한 1X TE 버퍼를 준비합니다. 제조 업체의 절차에 따라 nuclease 무료 물을 제공 20x TE 버퍼를 diluting하여 1xTE 버퍼를 준비합니다. 반응 볼륨은 200 μL로부터 거의 10 UL 범위 수 있습니다. 이 예제에서, 10 μL 반응 볼륨이 준비됩니다.
- nuclease 무료 튜브 또는 튜브에 배 최종 원하는 농도에 순차적으로 희석 dsDNA 표준을 준비합니다. nuclease 무료 호박이나 박 덮인 튜브 라벨 개별로 희석 dsDNA 기준의 각 5 μL를 전송합니다.
- 적절하게 표시 nuclease - 무료 호박이나 박 덮인 튜브에 관심 각각의 dsDNA 샘플의 나누어지는 5 μL.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 PicoGreen 작업 솔루션을 준비합니다. 관심의 표준 또는 샘플 (이 예에서는 5 μL) 중 하나를 포함하는 각각의 튜브에 PicoGreen 작업 솔루션의 동일한 볼륨을 전송합니다.
- 참조 솔루션으로 제공하는 대조군을 준비하는 1X TE 버퍼와 PicoGreen 작업 솔루션의 동등 권을 결합합니다.
- 부드러운 pipetting에 의해 철저하게 각각의 반응 관의 내용을 섞어 5 분 실온에서 반응을 품어. 형광 신호가 온도의 영향으로 모든 기준과 샘플을 측정하기 전에 동일한 온도 equilibrated해야합니다.
- 악기를 준비하고 측정을 수행하려면 먼저 샘플 유지 시스템의 낮은과 상부 표면을 청소하십시오. 낮은 광학 표면에 탈이온수의 Pipet 2-3 μL가 가까이 후 레버 팔을 열고 깨끗하고 보푸라기가 무료로 상단과 하단 받침대를 얼룩, 연구실 닦으십시오. 표면은 보풀이 여기 소스의 존재에 형광 전시하고 측정을 방해할 수로 진행하기 전에 보푸라기가 무료입니다 보장합니다.
- , 악기 소프트웨어를 열고 "핵산"응용 프로그램을 선택하고 "PicoGreen - dsDNA"옵션을 선택합니다.
- 악기를 공백으로, 하단 받침대에 1X TE 2 μL를 추가 팔을 가까이하고 악기 소프트웨어 분야에서 "공백"을 선택하십시오. 일단 비어가 완료, 샘플 유지 시스템의 두 표면에서 빈 솔루션을 얼룩.
- 부드러운 pipetting하여 레퍼런스 솔루션을 섞는다. 하단 받침대에 낮은 유지 팁, 피펫 2 μL를 사용하고 팔을 닫습니다.
- 측정 타입의 "참조"를 선택하고 원하는 단위를 선택합니다. 측정주기를 시작하려면 "법안"을 클릭하십시오.
- 측정주기가 완료되면, 팔을 열고 철저하게 샘플 보존 시스템 표면을 얼룩. 다섯 최대 측정하면 각 복제에 대한 새로운 나누어지는을 사용하여 참조 복제합니다.
- 표준 곡선을 구축하기 위해 추가적인 표준 프로세스를 반복합니다. 최대 일곱 기준은 사용할 수 있습니다. 소프트웨어는 5 각 표준에 대한 복제를 저장할 수 있도록 설계되었습니다. 표준의 복제는 샘플 농도가 자동으로 결정되는에서 표준 곡선을 생성하기 위해 평균입니다.
- 표준 곡선이 완료되면, "샘플"탭을 선택하고 각각의 샘플 ID 정보를 입력하고 각각의 미지의 샘플을 측정합니다.
Discussion
여기에 제시 quantitation 프로토콜은 가장 널리 인정 microvolume 시스템을 기반으로합니다. 이러한 시스템은 큰 샘플 볼륨 억제 장치의 사용에 의존하는 전통적인 핵산 quantitation 방법론에 대한 실질적인 대안을 제공합니다.
NanoDrop microvolume 기술은 액체 칼럼을 형성 측정되는 시료의 표면 장력 특성에 의존 샘플 보존 시스템을 사용합니다. 이것은 예제는 적절한 열 형성을위한 상위 및 하위 광학 측정 표면과 접촉을하게되는 중요합니다. 측정 결과가 부정확하거나 재현할 수없는 것 어떤 시점에서면, 그것은 대부분 샘플 이질이나 액체 열 파손의 결과입니다.
세제 및 이소 프로필 알코올은 그들이 클수록 측정 표면을 uncondition 수 있으므로 요원을 청소하지 않는 것이 좋습니다. 무조건 받침대는 샘플 비말의 평평화 그 결과, 받침대의 소수성 표면 특성이 손상되었을 경우에 발생합니다. 무조건 받침대는 측정하는 동안 액체 칼럼의 파손으로 이어질 수 있습니다.
그림 3. 무조건 표면은 물의 비말의 평평화이 특징입니다.
Uncondtioned 페데 스탈의 표면은 NanoDrop 받침대 Reconditioning 컴파 운드 (PR - 1, 써모 과학 NanoDrop 제품)를 사용 reconditioned 수 있습니다. reconditioning 화합물의 얇은 레이어 ~ 30 초 동안 건조 허용 상단 및 하단 받침대 표면에 적용되는 다음, 깨끗하고, 건조, 보푸라기가없는 실험실을 사용하여 닦아에서 문질러서. 성공적으로 reconditioned 상태는 바닥 받침대 표면에 적용할 때 구슬 세공 물 비말에 의해 특징입니다.
그림 4. reconditioned 표면은 물의 비말 최대 구슬 장식이 특징입니다.
Microvolume의 quantitation 시스템은 크게 샘플 소비를 줄이고보다 전통적인 부량 시스템에 비해 급격하게 농도 범위를 향상시킬 수 있습니다. microvolume의 quantitation는 종종 제한된 세포 바늘 biopsies 및 레이저 캡처 microdissection 같은 대량의 효율성과 편의의 사용이 방법론은 만들었습니다 그것 널리 인정하는 대신 전통적인 핵산 quantitation 방법에 관련된 상황에 대한 사용 기술되어 있지만도 샘플 풍부한 경우.
Disclosures
필립 데자르뎅와 데브라 콘클린이 문서에서 사용되는 악기를 생산 써모 과학 NanoDrop 제품, 병원에서 근무하고 있습니다.
Acknowledgments
리처드 W. 베린저와 데이비드 L. 애쉬, 기술 지원 및 촬영에 대한 응용 과학자, 써모 사이 언티픽 NanoDrop 제품.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-2000C | |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
References
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