Summary
Использование системы NanoDrop микрообъеме практические и эффективные альтернативы традиционной методологии количественного нуклеиновых кислот описывается через демонстрацию двух микрообъеме нуклеиновых протоколами количественного кислоты.
Abstract
Биомолекулярных анализов постоянно развивается постепенно, использующих меньшее количество материала, часто исключающих применение обычных кювет основе инструментов для нуклеиновых кислот количественного для тех, которые могут выполнять микрообъеме количественного определения.
NanoDrop образец микрообъеме удерживающая система (Thermo Продукты Научно NanoDrop) функции путем объединения волоконно-оптических технологий и природных свойств поверхностного натяжения, чтобы захватить и удерживать незначительное количество образца независимо от традиционного аппарата сдерживания таких как кювет или капилляров. Кроме того, система использует более короткий путь длины, что приводит к широкому спектру нуклеиновых измерения концентрации кислоты, по существу, избавляя пользователя от необходимости выполнять разведения. Сокращение объема образцов, необходимых для спектрального анализа также облегчает включение дополнительных мер контроля качества на протяжении многих молекулярные процессы, повышая эффективность и в конечном итоге приводит к большей уверенности в нижнем течении результаты.
Необходимость высокой чувствительности флуоресцентного анализа ограниченной массы также появились с недавних экспериментальных достижений. Используя ту же технологию удержания образца микрообъеме, флуоресцентные измерения могут быть выполнены с 2 мкл материала, что позволяет флуоресцентные объем анализов требования, которые должны значительно сокращен. Такие microreactions от 10 мкл или менее теперь возможно с помощью выделенного fluorospectrometer микрообъеме.
Два микрообъеме нуклеиновые кислоты протоколами количественного будет показано, что использование интегрированных пример сохранения системы как практические альтернативы традиционным кювет основе протоколов. Во-первых, прямой A260 поглощения методом с использованием спектрофотометра микрообъеме описано. Это сопровождается демонстрацией флуоресценции основе метода, который позволяет снизить объемы флуоресценции реакции с fluorospectrometer микрообъеме. Эти новые методы позволяют оценивать нуклеиновых кислот концентрацией от 1 пг / мкл до 15000 нг / мкл с минимальным потреблением образца.
Protocol
1. Микрообъеме нуклеиновых кислот с использованием количественного NanoDrop 2000c Спектрофотометр
- Во-первых, чистые верхние и нижние оптических поверхностей образца микрообъеме система удержания спектрофотометр с помощью пипетки 2 до 3 мкл чистой деионизированной воды на нижнюю оптической поверхности.
- Закройте рычаг, гарантируя, что верхний пьедестал вступает в контакт с деионизированной водой. Поднимите рычаг и вытрите как оптические поверхности чистой, сухой, без ворса протрите лаборатории.
- Открытое NanoDrop программного обеспечения и выберите нуклеиновых кислот приложений. Использование небольшого объема, калиброванные пипетки для выполнения измерений по пустым дозирования 1 мкл буфера на нижнюю оптической поверхности. Нижний рычаг и выберите "Blank" в нуклеиновые кислоты приложений.
- Как только пустые измерение завершено, чистый как оптические поверхности чистой, сухой, без ворса протрите лаборатории.
- Выберите подходящий для постоянного образца, который должен быть измерен.
Таблица 1. Типичные нуклеиновой кислоты концентрацией диапазоны для прямого поглощения A280 измерений с помощью NanoDrop микрообъеме спектрофотометр, традиционные кювет основе спектрофотометра использоваться с TrayCell микроэлемент кювет и fluorospectrometer микрообъеме NanoDrop в сочетании с анализа PicoGreen.Тип пробы Выберите вариант Постоянное используется для расчета концентрации дц ДНК-50 50 оцДНК ДНК-33 33 РНК РНК-40 40 Oligo Обычай 15-150 - Внесите 1 мкл нуклеиновой кислоты образца на нижний оптический пьедестал и закрыть рычаг. Потому что измерение объема независимой, образец нужно только преодолеть разрыв между двумя оптическими поверхностями для измерения должны быть сделаны.
- Выберите "Мера" в прикладном программном обеспечении. Программное обеспечение автоматически рассчитает нуклеиновой кислоты концентрации и чистоты отношений. После измерения пробы, анализ спектральных выход.
- Программное обеспечение автоматически рассчитает нуклеиновой кислоты концентрации и чистоты отношений. После измерения пробы, анализ спектральных изображений для оценки качества образцов.
- Типичный образец нуклеиновых кислот, будет иметь очень характерный профиль.
Рисунок 1. Типичный образец нуклеиновых кислот, будет иметь очень характерный профиль. - Общие источники загрязнения, связанные с конкретными нуклеиновых кислот включают изоляцию Фенол / Trizol и столбцов добычи. В случае фенола / Trizol добычи, остаточное загрязнение реагентов может быть обозначено ненормальным спектра от 220 до 240 нм, а также сдвиги в 260 до 280 нм. И наоборот, остаточная гуанидина из колонки добычи может способствовать пик вблизи 230 нм и сдвиг в корыто от 230 нм до приблизительно 240 нм.
Рисунок 2. Сдвиги в пики и впадины образцов В и С по сравнению с образцом иллюстрации того, как загрязняющие вещества могут влиять на спектры нуклеиновых кислот. - Чтобы точно оценить качество образцов, 260/280 или 260/230 отношения должны быть проанализированы в сочетании с общей спектрального качества. Чистая нуклеиновых кислот обычно дает 260/280 отношение ~ 1,8 и 260/280 отношение ~ 2,0 для ДНК и РНК, соответственно. Это соотношение зависит от рН и ионной силы буфера используется, чтобы сделать пустым и выборочных измерений. Кислотные растворы будет недостаточно представляют соотношение 0,2-0,3, в то время как основное решение будет чрезмерно представляют соотношение 0,2-0,3. Значительно различных соотношениях чистоты может указывать на наличие белка, фенола или других загрязняющих веществ, которые поглощают сильно в или около 280 нм. 260/230 чистоты соотношение Вторая мера чистоты ДНК со значениями для "чистой" нуклеиновой кислоты, обычно в диапазоне 1,8-2,2. Чистота отношений, которые значительно ниже, чем ожидаемые значения может указывать на изоляцию техника, используемая могут потребовать дальнейшей оптимизации.
- NanoDrop спектрофотометры также может быть использована для количественного белков с использованием прямого поглощения или белка колориметрических анализов. Для обеспечения правильного формирования колонны и воспроизводимость, 2-мкл образцов рекомендуется для белка образцов. См. следующее видео Юпитера: микрообъеме концентрации белка Определение Использование NanoDrop Спектрофотометр http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610
- Чтобы продемонстрировать высокую чувствительность микрообъеме нуклеиновых кислот с использованием количественного NanoDrop 3300, комплект PicoGreen флуоресценции используется. Во-первых, равновесие комплект стандартов и всех нуклеиновых кислот до комнатной температуры. Флуоресцентные образцов светочувствительных и должен храниться в янтаре или алюминиевых труб упаковке.
- Подготовка достаточно 1x TE буфера для всех стандартов и образцов для измерения, а также для PicoGreen рабочего раствора, которые будут необходимы. Подготовка 1xTE буфера путем разбавления при условии, 20x TE буфера с нуклеазы без воды в соответствии с протоколом производителя. Реакция объемов может составлять от 200 мкл до всего лишь 10, ул. В этом примере, 10 мкл реакция будет подготовлен.
- Подготовка последовательно разбавлены дцДНК стандартов на скорости 2х окончательной желаемой концентрации в нуклеазы без флаконах или трубках. Передача 5 мкл каждого из разбавленных стандартов двухцепочечной ДНК в отдельных помечены нуклеазы без янтаря или фольгой покрытых труб.
- Алиготе 5 мкл каждого образца дцДНК интереса в соответствующей маркировкой нуклеазы без янтаря или фольгой покрытых труб.
- Подготовка PicoGreen рабочего раствора в соответствии с протоколом производителя. Передача равным объемом PicoGreen рабочего раствора в каждую пробирку, содержащие либо стандартного или образец интерес (5 мкл в данном примере).
- Комбинат равные объемы 1x TE буфера и PicoGreen рабочего раствора для подготовки отрицательного контроля, который служит в качестве раствора сравнения.
- Смешайте содержимое каждой реакционной трубы тщательно, осторожно пипеткой и инкубировать реакции при комнатной температуре в течение 5 минут. Все стандарты и образцы должны быть доведены до той же температуры до измерения, сигнал флуоресценции зависит от температуры.
- Для подготовки документа и проводить измерения, в первую чистую нижней и верхней поверхностях системы удержания образца. Внесите 2 до 3 мкл деионизованной воды на нижнюю оптической поверхности, рядом откройте рычаг, и промокните верхнего и нижнего основания с чистым, без ворса, лабораторные салфетки. Обеспечить поверхности свободны от нибудь вкусненькое прежде чем приступить, как ткань может выставить флуоресценции в присутствии источника возбуждения и может вмешиваться в измерения.
- Открытый программный инструмент, выберите "нуклеиновые кислоты" приложение и выберите "PicoGreen-дц" вариант.
- Для пустой документ, добавьте 2 мкл ТЕ-1x в нижний постамент, рядом руку, и выберите "Blank" в области программного инструмента. Как только заготовка полной, пятно от пустое решение с обеих поверхностях системы удержания образца.
- Смешайте раствор сравнения, осторожно пипеткой. Использование низких советы удержания, пипетки 2 мкл на нижний постамент и закрыть рукой.
- Выберите "ссылку" в тип измерения и выберите желаемый единиц. Нажмите "Мера", чтобы начать цикл измерений.
- Когда цикла измерения полного, открытого руки и тщательно пятно с поверхности образцов удерживающей системы. Мера до пяти повторов ссылки, используя свежие аликвоту для каждой репликации.
- Повторите эту процедуру для дополнительных стандартов для создания калибровочной кривой. До семи стандарты могут быть использованы. Программа предназначена для хранения до пяти повторяет для каждого стандарта. Репликация стандартов усредняются для получения стандартной кривой, из которой образец концентрации определяются автоматически.
- После стандартной кривой завершена, выберите "Образцы" на вкладке, введите соответствующую информацию ID образцом и мерой каждого неизвестного образца.
Discussion
Количественного протоколы, представленные здесь, основаны на наиболее широко признанных микрообъеме систем. Такие системы обеспечивают практические альтернативы для традиционных нуклеиновых методологии количественного кислоты, которые полагаются на большее объемы проб и использование сдерживания аппарата.
NanoDrop микрообъеме технология работает система удержания образца, который полагается на поверхностное натяжение свойства образца измеряется в форме столба жидкости. Очень важно, чтобы образец вступает в контакт с верхней и нижней поверхностях оптических измерений для правильного формирования колонки. Если в любой момент результаты измерений, кажется неточным или не воспроизводимы, то, скорее всего результат неоднородности образца или жидкости поломки колонки.
Моющие средства и изопропиловый спирт, не рекомендуется чистящие средства, поскольку они могут uncondition поверхности пьедестала измерения. Безусловных пьедестал происходит, когда гидрофобные свойства поверхности пьедестала были скомпрометированы, в результате чего уплощение образца капли. Безусловное пьедесталы может привести к поломке столба жидкости во время измерения.
Рисунок 3. Безусловное поверхность характеризуется уплощением капли воды.
Uncondtioned поверхности пьедестал может быть восстановленные использованием NanoDrop Пьедестал Восстановление соединений (ПР-1, Thermo Scientific NanoDrop продукты). Тонкий слой восстановление соединения применяется к верхней и нижней поверхностях пьедестала, дают высохнуть в течение ~ 30 секунд, затем стирается с помощью чистой, сухой, без ворса протрите лаборатории. Успешно восстановленное состояние характеризуется капли воды бисером, когда наносится на поверхность пьедестала вниз.
Рисунок 4. Восстановленное поверхность характеризуется бисером из капли воды.
Системы микрообъеме количественного значительно сократить потребление и образец значительно увеличить диапазон концентраций по сравнению с более традиционными системами количественной оценки. Хотя микрообъеме количественного нередко становится технологией для обстоятельств, связанных с ограниченным клеточной массы, таких как иглы биопсии и лазерно-захвата микродиссекции, эффективность и простоту в использовании данной методики дало широкое признание альтернативой традиционным методам количественного нуклеиновые кислоты даже когда образец имеется в изобилии.
Disclosures
Филипп Дежарден и Дебра Конклин являются сотрудниками Thermo Scientific Продукты NanoDrop, Inc, которая производит инструменты, используемые в этой статье.
Acknowledgments
Ричард У. Берингер и Дэвид Л. Эш, Приложения Ученые, Термо продукты Научно NanoDrop, для оказания технической помощи и съемок.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-2000C | |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-3300 |
References
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity. BioTechniques. 22, 474-481 (1997).
- Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. Implen Applications Note. , Munich, Germany. (2006).
- Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. Spectrochemical analysis. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).
- Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA. Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).
