Imagen óptica de neuronas en el ganglio Cangrejo Stomatogastric con tintes sensibles al voltaje

Summary

Aquí se presenta la metodología para la resolución rápida y de alta fluorescentes sensibles al voltaje de imágenes tinte de la actividad detallada de las neuronas en el ganglio stomatogastric cangrejo.

Abstract

Sensibles al voltaje de imágenes tinte de las neuronas es una metodología clave para la comprensión de cómo las redes neuronales se organizan y cómo la actividad simultánea de neuronas que participan conduce a la aparición de la funcionalidad integral de la red. Aquí se presenta la metodología de aplicación de esta técnica a las neuronas generando patrón identificado en el ganglio de cangrejo stomatogastric. Se demuestra la carga de estas neuronas con los fluorescentes sensibles al voltaje tinte Di-8-ANEPPQ y nos muestran cómo la imagen de la actividad de las neuronas tinte cargado con la velocidad MiCAM02 alta y de alta resolución CCD sistema de cámara de imagen. Se demuestra el análisis de los datos de imágenes grabados con el software de imágenes BVAna asociados con el sistema de imágenes MiCAM02. La simultánea de imágenes sensibles al voltaje medio de contraste de la actividad detallada de múltiples neuronas en el ganglio de cangrejo stomatogastric aplicarse junto con las técnicas tradicionales de electrofisiología (registros intracelulares y extracelulares) abre radicalmente nuevas oportunidades para la comprensión del funcionamiento de centrales generador de patrones de las redes neuronales.

Protocol

1. Preparación del cangrejo del Sistema Nervioso Stomatogastric

Adultos Cancer pagurus L. fueron obtenidos de fuentes locales (Universidad de Newcastle, Paloma Marina de Laboratorios) y se mantienen en filtrada, el agua de mar aireada (10 - 12 ° C). Los animales fueron anestesiados por el embalaje en hielo durante 20 - 40 min antes de la disección. Hemos utilizado los sistemas aislados stomatogastric nervioso (STNS) ^1. El STNS fue precisado en un elastómero de silicona forrada (ELASTOSIL RT-601, Wacker, Munich, Alemania), placa de Petri y superfused continua (7 - 12 ml / min) con solución salina fría (10-13 ° C). Solución salina fisiológica consistió en (mmol * l-1): NaCl, 440; MgCl _2, 26; CaCl _2, 13; KCl, 11; trisma base, 10; ácido maleico, 5. Solución salina se mantiene a una temperatura constante de 11 a 13 ° C y un pH de 7,4 a 7,6.

Los pasos detallados de la disección STNS y preparación, incluyendo el desheathing del ganglio stomatoastric (STG), se presentan en el artículo JoVe por Gutiérrez y Grashow ^1. Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva Europea del Consejo de Comunidades ^º 24 de noviembre 1986 (86/609/CEE). La figura 1A muestra un diagrama esquemático de la STNS y Figura 1B muestra una típica STG desheathed que sus neuronas dispuestas en un semicírculo plana en la parte posterior del ganglio.

La placa de Petri con la STNS se fija a la plataforma operativa del microscopio de imagen (BW51 WI, Olympus, Tokio, Japón) con plastilina. Tanto, la platina del microscopio, el microscopio se montan sobre una mesa de vibración aislada (Scientifica, Uckfield, Reino Unido) para evitar que los artefactos movimiento durante la grabación óptica. Los patrones motores generados en el ganglio stomatogastric (STG) se determinan con grabaciones extracelular ^2-4. Esto se hace a través de los siguientes pasos:

1. Un compartimiento de vaselina basado cilíndrico está construido alrededor de una sección del nervio motor principal (LVN) para aislar eléctricamente el nervio del baño (esto se hace en el escenario antes de la disección de la placa de Petri se coloca en la plataforma de funcionamiento del microscopio de imagen ).
2. Uno de los dos alambres de acero inoxidable electrodo se coloca en este compartimiento, y el otro en el baño como un electrodo de referencia.
3. La señal diferencial se registra, se filtra y amplifica con un amplificador diferencial AC (Universidad de Kaiserslautern, Alemania).
4. La actividad motora del ganglio se controla mediante un osciloscopio (DL708E, Yokogawa, Tokio, Japón) y es, además, grabado con una tarjeta de adquisición de datos (Power CED, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, Reino Unido) y la Espiga de 2 v6.10 software (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). Los archivos son analizados mediante el de Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK).

2. Preparación de la solución de colorante

Se utilizaron los fluorescentes sensibles al voltaje tinte Di-8-ANEPPQ (Cambridge Bioscience) ^5, que tiene una doble carga positiva que facilita la carga de la tinta a través de microelectrodos positivos mediante el uso de pulsos de corriente. La solución de colorante debe ser protegido de la luz tanto como sea posible. La solución colorante se prepara de la siguiente manera:

1. 5 mg de tintura se mezcla con 1 ml de ácido Pluronic F-127 en DMSO (Invitrogen) solución.
2. El vial de plástico que contienen el colorante disuelto se centrifuga durante 20 minutos a 12.000 rotaciones / minuto en una microcentrífuga 01.14 Sigma (Sigma, Osterode, Alemania) para separar las partículas más grandes tintes que pueden obstruir los microelectrodos.
3. El sobrenadante (top 200 l) de la solución de colorante se separa mediante una pipeta y se almacena en un frasco de plástico por separado. Ambos viales se envuelven en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz.
4. La solución colorante se congela a -20 ° C.
5. Antes de utilizar la solución de colorante que se derrita, colocando el frasco cerrado y envuelto en agua tibia (25 ° C) durante 10-15 minutos.

3. Colorante de carga por inyección intracelular con microelectrodos de Sharp

Hemos utilizado microelectrodos fuerte para cargar las neuronas con el tinte. Para comprobar la carga de tintes que utilizamos el sistema de imágenes MiCAM02 (SciMedia, Tokio, Japón) ^6. El sistema de imágenes cuenta con dos cámaras CCD: la cámara de recursos humanos tiene un chip sensor de mayor tamaño (6,4 mm x 4,8 mm) proporciona una mejor resolución espacial con la mejor resolución temporal que 1,4 ms, la cámara del SA, tiene un menor (2,9 mm x 2,1 mm), pero más rápido chip sensor que permite más rápido de imágenes que tengan 0,7 ms como su mejor resolución temporal. Los pasos de la carga de tintes son los siguientes:

1. Microelectrodos se tira con un P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, EE.UU.), extractor de electrodo con 10 cm de largo, 1 mm de diámetro exterior de los tubos de vidrio de filamento (GB100TF 8P, Science Products, Hofheim, Alemania). Los electrodos se retiró para tener una resistencia en elrango de 25 a 40 MOhm en KCl 3M (para tirar adecuada configuración de los parámetros siguen el libro de cocina pipeta provista por el fabricante del extractor de electrodos).
2. La solución de colorante congelado es fundido y una cantidad muy pequeña de la que es absorbida en una aguja Microfil (Microfil - 34G, Instrumentos del Mundo de precisión, Sarasota, FL, EE.UU.) - el colorante absorbido llena alrededor de ^RD 2 / 3 de la aguja Microfil .
3. La solución de colorante en la aguja Microfil se inyecta en la punta de un microelectrodo. El micro se coloca en una caja oscura durante 15 minutos.
4. El micro se rellena con solución de KCl 3M. El electrodo se coloca de nuevo en una caja de almacenamiento de electrodo oscuro para otros 10-20 minutos para permitir que la solución de colorante para llegar a la fina punta del electrodo por la succión de la fuerza capilar que en el microelectrodo.
5. El micro listo se coloca en un porta-electrodo y se fija en el headstage del amplificador intracelular (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, EE.UU.).
6. El amplificador intracelular está conectado a la tarjeta de adquisición de datos que proporciona una señal de pulso para conducir impulsos de corriente en el microelectrodo.
7. El micro se coloca suavemente en la membrana de una neurona STG utilizando un manipulador de microelectrodos (PatchStar, Scientifica Ltd, Uckfield, Reino Unido). Desde la distancia de trabajo de los objetivo de 10x (UMPLFL10XW, NA 0,30, WD 3,3 mm, Olympus Corporation, Tokio, Japón) del microscopio de imagen es muy pequeña, el microelectrodo se debe colocar en posición oblicua (alrededor de 30 °) y el movimiento de los microelectrodos en la posición correcta requiere de varios pasos de la reorientación de los objetivos del microscopio y el movimiento de microelectrodos. Para iniciar el microelectrodo se mueve en una posición tal que la punta está por encima del STG. El objetivo del microscopio se baja hasta que la punta del electrodo aparece en foco. Luego de que se baje aún más, pero no tanto para tocar el microelectrodo. El micro se baja hasta que vuelva a aparecer en el foco del objetivo. Estos pasos se repiten hasta que las neuronas aparecen claramente en el plano de enfoque del objetivo. A continuación, el microelectrodo se baja hasta que toque suavemente y penetra en la membrana de la neurona STG seleccionado. Este control se ejerce mediante el osciloscopio.
8. El electrodo intracelular se utiliza para registrar la actividad de la neurona STG seleccionados con el fin de identificar las neuronas debido a su perfil de actividad y la relación entre su actividad y la actividad STG registrado desde el electrodo extracelular ^2,3,7.
9. El amplificador intracelular pasa a modo de inyección de corriente y se utiliza durante 30 minutos para inyectar 10 nA pasos positivos actuales en el microelectrodo que duran un segundo y están separados por un segundo vacíos sin corriente inyectada en el microelectrodo. Las unidades de la corriente inyectada moléculas cargadas positivamente medio de contraste en las neuronas registradas. Si se dispone de equipos múltiples neuronas puede ser inyectado al mismo tiempo.
10. Diez minutos en el período de inyección y después de la final de la inyección de la propagación de tinte dentro de la neurona está activada. Para ello se utiliza el sistema MiCAM02 imágenes (SciMedia Ltd, Tokio, Japón) con el objetivo de 10x e iluminación de la fuente de luz ultra-baja ondulación halógenas (HL-151; Moritex, Tokio, Japón) a través de la MSWG2 cubo de filtro (con 480-550 nm de excitación filtro, Olympus Corporation, Tokio, Japón). El sistema de imagen está configurado para usar la cámara de recursos humanos con 192 píxeles de resolución x 128, 40 ms de tiempo de imágenes, el modo de "hbin ', y 10 cuadros por sesión de imágenes. Si el relleno colorante es el éxito de la imagen debe mostrar un parche coloreado en la neurona torno a la ubicación de los microelectrodos, y este parche teñido debe crecer entre las imágenes tomadas después de 10 minutos y después de 30 minutos. Si la difusión del colorante es insuficiente después de 30 minutos, más tiempo de inyección se concede. Por otra parte, un electrodo nuevo colorante puede ser utilizado.
11. El electrodo se sacó de la neurona y la neurona se deja descansar por lo menos 20-30 minutos. Dentro de este tiempo, la siguiente neurona puede ser inyectado con tinta.

4. Imágenes de las neuronas teñidas

La actividad de las neuronas individuales se pueden crear imágenes después de que el procedimiento de tintura de llenado. Por otra parte dos o más neuronas puede ser llenado con la imagen de la actividad simultánea de las neuronas STG varios. En principio muchas y posiblemente todas las neuronas STG puede ser llenado con medio de contraste. Las imágenes de las neuronas se hace con el 02 Micam sistema de imágenes con la cámara de recursos humanos. El procedimiento de la imagen es la siguiente:

1. El objetivo del microscopio se cambia y una transmisión de luz de alta eficiencia objetivo 20x (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0,95, WD de 2,0 mm, Olympus Corporation, Tokio, Japón) se utiliza para la recolección de datos de imágenes. Este objetivo se acumula mucha más luz que el objetivo de 10x y también le da un mayor aumento, proporcionando una imagen más detallada de las neuronas. Bein g eficiente significa más luz que una pequeña cantidad de colorante de carga ya es visible con este objetivo y que podemos utilizar una menor intensidad de la luz de la imagen reduciendo el daño potencial de fotos que pueden ser causados ​​a las neuronas por el tinte.
2. Etapa del microscopio operativo se coloca de tal manera que las neuronas que están destinados a ser reflejado en el campo de visión del objetivo y el objetivo se centra en ellos.
3. Los datos de registro extracelular también se introduce en el sistema de imágenes de Micam 02 a través de su canal de entrada analógica. Esto permite que la relación relativamente fácil de las señales ópticas y los patrones correspondientes de motor o picos extracelularmente registradas en la fase de análisis.
4. El sistema de Micam 02 está configurado para utilizar 96 x 64 píxeles de resolución con 2,2 ms de tiempo de imágenes o 48 x 32 píxeles de resolución con 1,5 ms de tiempo de imágenes. En ambos casos el "hbin 'ajuste se puede utilizar si el teñido de las neuronas no es muy fuerte.
5. El nivel de luz se ajusta lo más bajo posible (es decir, el medio de contraste en las neuronas que generan fluorescencia todavía suficiente para que la imagen) para evitar la foto de la modulación y la foto daño de las neuronas registradas.
6. La iluminación de la habitación y todas las fuentes de luz que queda se apaga. Además, un telón negro se puede cerrar todo el equipo de grabación para evitar exposición a la luz de fuentes externas.
7. Las sesiones de formación de imágenes se fijan para ser entre 4 a 16 segundos de duración.
8. La actividad espontánea de las neuronas teñidas se registra durante las sesiones de imágenes varias.

5. El análisis de los datos de imagen óptico

Para analizar los datos de imagen se utilizó el software BVAna (versión 10.08; SciMedia Ltd, Tokio, Japón) asociados con la MICAM 02 sistema de imágenes. El software es compatible con la visualización de los datos de imagen y ofrece una amplia gama de herramientas de análisis. Los pasos del análisis e interpretación de datos son los siguientes:

1. En la región apropiada circular de interés se selecciona en cada neuronas registradas. Normalmente se utiliza 2-3 regiones radio de píxeles de interés para la investigación de las neuronas en la resolución de 48 x 32 píxeles, y 6 - 8 regiones radio de píxeles de interés para la investigación de las neuronas en la resolución de 96 x 64.
2. La suavización temporal de los datos puede ser necesaria, especialmente si el medio de contraste genera cantidad relativamente baja de fluorescencia (valor de fondo de baja en los datos indica que esto, puede ser debido a la baja el nivel de luz que se utiliza o carga de bajo nivel medio de contraste, por ejemplo en las neuritas de las neuronas registradas). Normalmente en estos casos se utilizó el suavizado temporal de 3 a 5 unidades de tiempo.
3. Además de las grabaciones ópticas también mostrar el registro extracelular de la selección para mostrar la entrada analógica del sistema de imagen.
4. Los parámetros para la visualización de los datos ópticos y de la entrada analógica debe ser un valor apropiado para poder ver todas las grabaciones en la pantalla del ordenador.
5. Teniendo en cuenta las grabaciones ópticas de las neuronas, el registro extracelular de la LVN, y la clasificación de la neurona sobre la base de la grabación antes intracelular, es posible determinar la identidad de la neurona y relacionar su actividad con las actividades neuronales grabados de la los nervios.
6. Se espera que las grabaciones ópticas muestran claramente, y sin la necesidad de un promedio de más de varios eventos similares, las actividades neuronales que corresponden a los picos registrados extracelularmente y eventos subumbral como inhibidores potenciales postsinápticos causados ​​por la actividad de otras neuronas.
7. Las funciones de exportación de datos del software BVAna se puede utilizar para exportar las grabaciones ópticas calculadas para las regiones seleccionadas de interés y también la entrada analógica que contiene la grabación de la LVN. La exportación de datos pueden ser procesados ​​y analizados posteriormente con otros programas de análisis de datos, así (por ejemplo, en el caso más simple de Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE.UU.) se puede utilizar para la visualización y procesamiento de datos adicionales).

6. Resultados representante

La figura 2 muestra la grabación simultánea de dos neuronas (LP, lateral neurona pilórica, PD, pilórica dilatador neuronas) en el generador de patrones pilórica central de un cangrejo STG junto con la grabación de la LVN. Las grabaciones ópticas de las neuronas LP y EP identificados sobre la base de sus registros intracelulares muestran que, efectivamente, estos corresponden bien con las grabaciones correspondientes a las neuronas extracelular LP y EP. Hay un constante retraso de 12 ms entre las grabaciones ópticas y LVN de los picos de alza (ver recuadro de la Figura 2) debido a la demora en la transmisión axonal entre el ganglio y el sitio de registro extracelular. Los datos presentados también muestran que la actividad neuronal en el soma que corresponde a los picos de las neuronas registradas es claramente detectable.

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Figura 1. Un diagrama) Esquema del sistema nervioso stomatogastric (STNS). COG, el ganglio comisural, OG, ganglionares del esófago, STG, el ganglio stomatogastric, STN, los nervios stomatogastric; LVN, los nervios del ventrículo lateral. B) El ganglio cangrejo stomatogastric (STG) - La imagen muestra la disposición semicircular posterior de las neuronas STG.

Figura 2. Grabación simultánea de un solo barrido de un EP y un LP de neuronas junto con la grabación de la LVN. Los datos muestran que que las grabaciones ópticas y de los nervios partido muy bien y que podemos identificar las actividades neuronales que corresponden a los picos registrados forman el nervio. El recuadro muestra una superposición de varios barridos de potenciales de acción LP - tanto óptica y eléctrica registrado - y su promedio de demostrar la correspondencia entre las actividades de óptica y eléctrica registrado. Debido al hecho de que nuestro método de grabación óptica no filtra los componentes de baja frecuencia de los datos que también son capaces de registrar cambios lentos potencial de membrana característica de la EP y LP neuronas ^14.

Discussion

El medio de contraste de imagen sensibles al voltaje de ^8,9 STG las neuronas, en combinación con los métodos tradicionales de electrofisiología (grabaciones de electrodos intra y extracelular) permite una mejor comprensión de cómo funciona este pequeño, nervioso conocido y complejo aún el sistema. La STG es un prototipo de generador de patrones centrales (GPC) de las redes neuronales (que incluye las redes de planta de píloro gástrico y el ^{ritmo), 10, 11,} por lo tanto una mejor comprensión de las propiedades emergentes funcional de la STG también ayudará a entender cómo, en general, CPG generar redes de su funcionalidad a nivel de red. CPG redes juegan un papel crítico en el control motor ¹² y también en las funciones cognitivas superiores ^13, por lo tanto una mejor comprensión de sus propiedades emergentes pueden tener un gran impacto en muchas áreas de las neurociencias.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MiCAM02	SciMedia		Imaging system
BVAna v.10.08	SciMedia		Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system
HL-151	Moritex, Tokyo, Japan		Ultra-low ripple halogen light source
BX51 WI	Olympus Corporation		Upright microscope for epifluorescence imaging
20x imaging objective	Olympus Corporation	XLUMPLFL20XW/0.95	NA 0.95, WD 2.0mm
10x imaging objective	Olympus Corporation	UMPLFL10XW	NA 0.30, WD 3.3mm
Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter	Olympus Corporation	MSWG2
Antivibration table	Scientifica Ltd	63-534
PatchStar electrode manipulator	Scientifica Ltd	PS-7000C	Micro-electrode manipulator
CED Power 1401	Cambridge Electronic Design		Data acquisition board
DL708E Oscilloscope	Yokogawa		Intracellular amplifier
AC differential amplifier	University of Kaiserslautern, Germany		Extracellular amplifier
P-97 Flaming – Brown type electrode puller	Sutter Instrument Co.		Electrode puller
Sigma Microcentrifuge 1-14	Sigma-Aldrich		Centrifuge
Genex Pipettors Mline	Scientific Laboratory Supplies LTD	PIP7774	PIP7774
Glass micropipette with filament	Science Products	GB100TF 8P	Glass for micr–lectrodes
MicroFil – 34G	World Precision Instruments, Inc.		Microfil needle
Spike 2 v6.10	Cambridge Electronic Design		Electrophysiology software
Di-8-ANEPPQ	Cambridge BioScience	BT61014	Fluorescent voltage sensitive dye
F-127 Pluronic Acid, DMSO	Invitrogen	P-3000MP	Solvent
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Crab saline component
CaCl2 . 2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	Crab saline component
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	Crab saline component, electrolyte solution
MgCl2 . 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272	Crab saline component
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	Crab saline component
Maleic acid	Sigma-Aldrich	M0375	Crab saline component
Elastosil RT-601	Wacker, Munich, Germany		Lining of Petri dishes