Summary
Nous présentons ici la méthodologie utilisée pour la résolution rapide et de haute fluorescentes sensibles au voltage d'imagerie de l'activité de teinture détaillée des neurones dans le ganglion stomatogastric crabe.
Abstract
Sensibles au voltage d'imagerie colorant de neurones est une méthode clé pour la compréhension de la façon dont les réseaux neuronaux sont organisés et comment l'activité simultanée des neurones qui participent conduit à l'émergence de la fonctionnalité intégrale du réseau. Nous présentons ici la méthodologie d'application de cette technique pour générer des neurones schéma identifié dans le ganglion de crabe stomatogastric. Nous démontrons le chargement de ces neurones avec les fluorescents sensibles au voltage de teinture Di-8-ANEPPQ et nous montrer comment l'image de l'activité de teinture neurones chargés à l'aide de la vitesse élevée et MiCAM02 CCD haute résolution caméra d'imagerie du système. Nous démontrons l'analyse des données d'imagerie a enregistré en utilisant le logiciel d'imagerie BVAna associés au système d'imagerie MiCAM02. Le simultanée sensibles au voltage d'imagerie de l'activité de teinture détaillée des neurones dans le ganglion plusieurs crabes stomatogastric appliqué conjointement avec les techniques traditionnelles de l'électrophysiologie (enregistrements intracellulaires et extracellulaires) ouvre radicalement nouvelles opportunités pour la compréhension de la façon dont le travail générateur de pattern centrale réseaux neuronaux.
Protocol
1. Préparation du crabe du système nerveux Stomatogastric
Adult Cancer pagurus L. ont été obtenus auprès de sources locales (Université de Newcastle, Dove Marine Laboratories) et conservés dans filtré, eau de mer aérée (10 - 12 ° C). Les animaux ont été anesthésiés par les emballer dans de la glace pendant 20 - 40 min avant la dissection. Nous avons utilisé isolés stomatogastric systèmes nerveux (STNS) 1. Le STNS était coincé dans un élastomère de silicone-alignés (ELASTOSIL RT-601, Wacker, Munich, Allemagne) boîte de Pétri et continuellement perfusées (7 - 12 mL / min) avec une solution saline réfrigérée (10-13 ° C). Sérum physiologique se composait de (mmol * L-1): NaCl, 440; MgCl 2, 26; CaCl 2, 13; KCl, 11; Trisma de base, 10; acide maléique, 5. Saline a été maintenu à une température constante de 11 - 13 ° C et à pH 7,4 - 7,6.
Les étapes détaillées de la dissection STNS et de préparation, y compris le dégainage du ganglion stomatoastric (STG), sont présentés dans l'article JoVE par Guttierez et Grashow 1. Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec la directive des Communautés européennes du 24 e 1986 Novembre (86/609/CEE). La figure 1A montre un diagramme schématique de la figure 1B STNS et montre une STG typiques desheathed ayant ses neurones disposés comme un demi-cercle à plat dans la partie postérieure du ganglion.
La boîte de Pétri avec le STNS est fixé à la plate-forme d'exploitation de l'imagerie au microscope (BW51 WI; Olympus, Tokyo, Japon) avec la pâte à modeler. Tous les deux, la platine du microscope et la loupe sont montés sur une table de vibration isolée (Scientifica, Uckfield, Royaume-Uni) afin d'éviter les artéfacts de mouvement lors de l'enregistrement optique. Les schémas moteurs générées dans le ganglion stomatogastric (STG) sont suivis en utilisant des enregistrements extracellulaires 2-4. Ceci est fait par les étapes suivantes:
- Un compartiment de gelée de pétrole à base cylindrique est construite autour d'une section du nerf moteur principal (LVN) pour isoler électriquement le nerf de la baignoire (cela se fait sur la scène de dissection avant la boîte de Pétri est placé sur la plate-forme d'exploitation de l'imagerie au microscope ).
- Un des deux fils électrodes inox acier est placé dans ce compartiment, l'autre dans le bain comme une électrode de référence.
- Le signal différentiel est enregistré, filtré et amplifié par un amplificateur différentiel AC (Univ. Kaiserslautern, Allemagne).
- L'activité motrice du ganglion est contrôlée au moyen d'un oscilloscope (DL708E; Yokogawa, Tokyo, Japon) et est en outre enregistré en utilisant une carte d'acquisition de données (alimentation DEC, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK) et le Spike 2 v6.10 logiciel (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). Les fichiers sont analysés à l'aide de Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK).
2. Préparation de la solution de colorant
Nous avons utilisé le fluorescentes sensibles au voltage de teinture Di-8-ANEPPQ (Cambridge Bioscience) 5, qui a une double charge positive qui facilite le chargement du colorant à travers microélectrodes en utilisant des impulsions de courant positives. La solution de colorant doit être protégé de la lumière autant que possible. La solution de colorant est préparé comme suit:
- 5 mg de colorant est mélangé avec 1 ml d'acide Pluronic F-127 dans le DMSO (Invitrogen) solution.
- Le flacon en plastique contenant le colorant dissous est centrifugé pendant 20 minutes à 12 000 rotation / minute dans une microcentrifugeuse Sigma 1-14 (Sigma, Osterode, Allemagne) afin de séparer des particules de colorant grands qui peuvent obstruer les microélectrodes.
- Le surnageant (Top 200 pi) de la solution de colorant est séparé à l'aide d'une pipette et stockés dans un flacon en plastique séparé. Les deux flacons sont emballés dans du papier aluminium pour éviter l'exposition à la lumière.
- La solution de colorant est congelé à -20 ° C.
- Avant d'utiliser la solution de colorant est fondu en plaçant le flacon fermé et enveloppé dans chaude (25 ° C) de l'eau pendant 10-15 minutes.
3. Chargement colorant par injection intracellulaire aide de microélectrodes de Sharp
Nous avons utilisé des microélectrodes forte pour charger les neurones avec le colorant. Pour vérifier le colorant de charge, nous utilisons le système d'imagerie MiCAM02 (SciMedia, Tokyo, Japon) 6. Le système d'imagerie possède deux caméras CCD: la caméra RH a une puce capteur plus grand (6,4 mm x 4,8 mm) offrant une meilleure résolution spatiale avec la meilleure résolution temporelle étant de 1,4 ms, la caméra HS a un plus petit (2,9 mm x 2,1 mm), mais rapide puce de capteur permettant rapidement d'imagerie ayant 0,7 ms comme sa meilleure résolution temporelle. Les étapes du colorant de charge sont les suivants:
- Microélectrodes sont tirés avec un P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, USA) Extracteur d'électrodes à l'aide de 10 cm de long, 1 mm de diamètre externe des tubes de verre avec filament (GB100TF 8P, Science Products, Hofheim, Allemagne). Les électrodes sont tirés d'avoir une résistance à lagamme de 25 à 40 MOhm en 3M KCl (pour les réglages des paramètres appropriés tirant suivre le livre de la pipette fournie par le fabricant de l'extracteur d'électrode).
- La solution de colorant congelé est fondu et une très petite quantité de celui-ci est aspiré dans une aiguille Microfil (Microfil - 34G, Instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride, USA) - le colorant aspirée remplit autour ème 2 / 3 de l'aiguille Microfil .
- La solution de colorant dans l'aiguille Microfil est injecté dans l'extrémité d'une microélectrode. La microélectrode est placée dans une boîte sombre pendant 15 minutes.
- La microélectrode est remblayé avec 3M KCl solution. L'électrode est ensuite replacée dans une boîte de rangement pour une autre électrode noire 10-20 minutes pour permettre à la solution de colorant pour atteindre la pointe fine de l'électrode par l'aspiration de la force capillaire agissant dans la microélectrode.
- La microélectrode prêts est placé dans un porte-électrode et fixé sur la headstage de l'amplificateur intracellulaire (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, USA).
- L'amplificateur intracellulaire est connecté à la carte d'acquisition de données qui fournit un signal d'impulsion pour conduire les impulsions de courant dans la microélectrode.
- La microélectrode est placé délicatement dans la membrane d'un neurone à l'aide d'un manipulateur STG microélectrode (PatchStar, Scientifica Ltd, Uckfield, Royaume-Uni). Comme la distance de travail de l'objectif 10x (UMPLFL10XW, NA 0.30, WD 3.3mm; Olympus Corporation, Tokyo, Japon) du microscope d'imagerie est très faible, la microélectrode doit être placé dans une position oblique (environ 30 °) et le mouvement de la microélectrode dans la bonne position nécessite plusieurs étapes de re-focalisation de l'objectif du microscope et en déplaçant les microélectrodes. Pour lancer la microélectrode est déplacée dans une position telle que son extrémité se trouve au-dessus du STG. L'objectif de microscope est abaissé jusqu'à la pointe de l'électrode apparaît au point. Puis il est descendu encore, mais pas autant toucher la microélectrode. La microélectrode est abaissée jusqu'à ce qu'il réapparaisse dans le foyer de l'objectif. Ces étapes sont répétées jusqu'à ce que les neurones apparaissent clairement dans le plan focal de l'objectif. Puis la microélectrode est abaissé jusqu'à ce qu'il touche et perce délicatement la membrane du neurone STG sélectionnés. Ceci est surveillé à l'aide de l'oscilloscope.
- L'électrode intracellulaire est utilisée pour enregistrer l'activité du neurone STG sélectionnés afin d'identifier le neurone donné son profil d'activité et la relation entre son activité et l'activité enregistrée STG de l'électrode extracellulaire 2,3,7.
- L'amplificateur intracellulaire est commuté en mode d'injection de courant et est utilisé pendant 30 minutes pour injecter 10 nA mesures positives en cours dans la microélectrode qui durent 1 seconde et sont séparés par une seconde sans lacunes courant injecté dans la microélectrode. Les lecteurs du courant injecté molécules chargées positivement colorant dans le neurone enregistré. Si l'équipement est disponible neurones multiples peuvent être injectés simultanément.
- Dix minutes après la période d'injection et après la fin de l'injection de la propagation de teinture dans le neurone est cochée. Pour ce faire nous utilisons le système d'imagerie MiCAM02 (SciMedia Ltd, Tokyo, Japon) avec l'objectif 10x et l'illumination par la source ultra-faible ondulation de lumière halogène (HL-151; MORITEX, Tokyo, Japon) à travers le cube de MSWG2 filtre (avec 480-550 nm d'excitation du filtre; Olympus Corporation, Tokyo, Japon). Le système d'imagerie est configuré pour utiliser la caméra HR avec 192 x 128 pixels résolution, 40 ms imagerie en temps, le mode 'hbin', et 10 images par séance d'imagerie. Si le remplissage de teinture est réussie, l'imagerie doit montrer un patch teints dans le neurone autour de l'emplacement de la microélectrode, et ce patch devrait teints poussent entre les images prises après 10 minutes et après 30 minutes. Si la propagation de la teinture est insuffisante après 30 minutes, le temps d'injection plus est accordée. Alternativement, une électrode de nouveau colorant peuvent être utilisés.
- L'électrode est sorti du neurone et le neurone est laissé à reposer pendant au moins 20-30 minutes. Dans ce temps, le neurone suivant peut être injecté avec la teinture.
4. Imagerie des neurones Teints
L'activité des neurones simples peuvent être visualisés après la procédure de teinture de remplissage. Alternativement deux ou plusieurs neurones peuvent être remplis à l'image de l'activité simultanée des neurones STG plusieurs années. En principe, de nombreux et, éventuellement, tous les neurones STG peut être rempli avec de la teinture. L'imagerie des neurones se fait avec le système d'imagerie MICAM 02 utiliser l'appareil photo RH. La procédure d'imagerie est comme suit:
- L'objectif de microscope est changé et une transmission à haute efficacité lumineuse 20x objectif (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0.95, WD 2.0mm; Olympus Corporation, Tokyo, Japon) est utilisé pour la collecte des données d'imagerie. Cet objectif recueille beaucoup plus de lumière que l'objectif 10x et donne également un plus fort grossissement offrant une image plus détaillée des neurones. Bein g plus de lumière que les moyens efficaces petite quantité de colorant de charge est déjà visible avec cet objectif et aussi que nous pouvons utiliser la lumière d'intensité plus faible pour l'imagerie réduire les dommages potentiels de photos qui peuvent être causés aux neurones par le colorant.
- Phase d'exploitation du microscope est positionné de telle sorte que les neurones qui sont destinés à être imagé sont dans le champ de vision de l'objectif et l'objectif est focalisé sur eux.
- Les données d'enregistrement extracellulaire est également introduite dans le système d'imagerie MICAM 02 grâce à son canal d'entrée analogique. Cela permet à la facilité relative relatives des signaux optiques et des schémas moteurs correspondants ou les pointes enregistrées dans le milieu extracellulaire phase d'analyse.
- Le système MICAM 02 est configuré pour utiliser la résolution 96 x 64 pixels avec 2,2 ms de temps d'imagerie ou de 48 x 32 pixels résolution avec 1,5 ms imagerie en temps. Dans les deux cas, le «hbin« réglage peut être utilisé si la teinture des neurones n'est pas très forte.
- Le niveau d'éclairage est fixé aussi bas que possible (c'est à dire le colorant dans les neurones devrait générer encore de fluorescence suffisante pour l'imagerie) afin d'éviter de photos de modulation et de dommages photo de neurones enregistrés.
- L'éclairage de la pièce et de toutes les sources lumineuses qui restent sont désactivés. De plus, un rideau noir peut être fermé autour du gréement pour empêcher l'enregistrement exposition à la lumière provenant de sources externes.
- Les séances d'imagerie sont configurés pour être entre 4 - 16 secondes de long.
- L'activité spontanée des neurones teints sont enregistrés sur plusieurs séances d'imagerie.
5. L'analyse des données d'imagerie optique
Pour analyser les données d'imagerie, nous avons utilisé le logiciel BVAna (version 10.08; SciMedia Ltd, Tokyo, Japon) associé à l'MICAM 02 système d'imagerie. Le logiciel supporte la visualisation des données d'imagerie et fournit une gamme d'outils d'analyse ainsi. Les étapes de l'analyse des données et l'interprétation sont comme suit:
- Une région appropriée circulaires d'intérêt est sélectionné sur chaque neurones enregistrés. Typiquement, nous utilisons 2 - 3 régions rayon de pixel d'intérêt pour enquêter sur les neurones à la résolution 48 x 32 pixels, et 6 - 8 régions rayon de pixel d'intérêt pour enquêter sur les neurones à 96 x 64 résolution.
- Le lissage temporel des données peut être nécessaire, surtout si le colorant génère quantité relativement faible de la fluorescence (valeur faible bruit de fond dans les données indique que cela, elle peut être à cause du niveau faible lumière qui est utilisée ou à faible niveau de colorant de charge, par exemple dans un neurites des neurones enregistrés). Habituellement, dans de tels cas, nous avons utilisé un lissage temporel avec 3 à 5 unités de temps.
- En plus des enregistrements optiques, nous aussi afficher l'enregistrement extracellulaire en sélectionnant pour afficher l'entrée analogique du système d'imagerie.
- Les paramètres pour la visualisation des données optiques et l'entrée analogique doit être réglé de façon appropriée afin de voir tous les enregistrements sur l'écran d'ordinateur.
- Considérant les enregistrements optiques des neurones, l'enregistrement extracellulaire de l'ISA, et la classification du neurone basée sur l'enregistrement intracellulaire tôt, il est possible de déterminer l'identité du neurone et de relier son activité à l'activité neuronale enregistrées à partir du nerveuses.
- Il est prévu que les enregistrements optiques montrent clairement, et sans la nécessité de l'étalement sur plusieurs événements similaires, les activités neuronales correspondant aux pics enregistrés et extracellulaire aussi des événements tels que infraliminaire inhibiteurs potentiels post-synaptiques causés par l'activité des autres neurones.
- Les caractéristiques des données d'exportation des logiciels BVAna peut être utilisé pour exporter les enregistrements optiques calculées pour les régions d'intérêt sélectionnées et l'entrée analogique qui contient l'enregistrement de la LVN. Les données exportées peuvent être traitées et analysées plus loin en utilisant d'autres logiciels d'analyse de données ainsi que (par exemple dans le cas le plus simple de Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, Etats-Unis) peut être utilisé pour la visualisation et le traitement des données supplémentaires).
6. Les résultats représentatifs
La figure 2 montre l'enregistrement simultané de deux neurones (LP, latéral pylorique neurone; PD, pylorique dilatateur neurone) dans le générateur de motif central du pylore d'un crabe STG combiné avec l'enregistrement de la LVN. Les enregistrements optiques des neurones LP et PD identifiés sur la base de leurs enregistrements intracellulaires montrent que ceux-ci correspondent en effet bien avec les enregistrements extracellulaires des neurones correspondant à LP et PD. Il ya un uniforme 12 ms de retard entre les enregistrements optiques et lvn des pics de pointe (voir encart de la figure 2) en raison du retard de transmission axonale entre le ganglion et le site d'enregistrement extracellulaire. Les données présentées montrent également que l'activité neuronale dans le soma qui correspond à des pointes de neurones enregistrés est clairement détectable.
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Figure 1. Un schéma) Schéma du système nerveux stomatogastric (STNS). COG, ganglion commissural; OG, le ganglion œsophagien; STG, le ganglion stomatogastric; STN, nerf stomatogastric; LVN, nerf du ventricule latéral. B) Le ganglion de crabe stomatogastric (STG) - l'image montre la disposition semi-circulaire postérieur de neurones STG.
Figure 2. Enregistrement simultané simple balayage d'une DP et un neurone LP combiné avec l'enregistrement de l'IVL. Les données montrent que le nerf optique et des enregistrements correspond très bien et que nous pouvons identifier les activités neuronales correspondant aux pics enregistrés forment le nerf. L'encart montre une superposition de plusieurs balayages de potentiels d'action LP - deux optiquement et électriquement enregistrées - et leur moyenne démontrant l'adéquation entre l'optique et des activités électriquement enregistrées. En raison du fait que notre méthode d'enregistrement optiques ne filtre pas les composants de basse fréquence des données que nous sommes également en mesure d'enregistrer des changements lents potentiel membranaire caractéristique de PD et LP neurones 14.
Discussion
Le colorant sensible au voltage d'imagerie 8,9 de STG neurones en combinaison avec des méthodes classiques d'électrophysiologie (enregistrements d'électrodes intra-et extracellulaire) permet une meilleure compréhension de la façon dont ce petit bien connu et toujours complexe fonctionne le système neuronal. Le STG est un prototype de centrale électrogène pattern (CPG) des réseaux neuronaux (il comprend les réseaux pylorique et gastrique rythme du moulin) 10, 11, donc une meilleure compréhension des propriétés émergentes fonctionnelle de la STG aidera également à comprendre comment, en général réseaux CPG génèrent leurs fonctionnalités au niveau du réseau. CPG réseaux jouent un rôle crucial dans le contrôle moteur 12 et également dans les fonctions cognitives supérieures 13, par conséquent, la meilleure compréhension de leurs propriétés émergentes peuvent avoir un impact majeur dans de nombreux domaines de la neuroscience.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous reconnaissons l'appui par l'École des sciences de l'informatique et de la Faculté des Sciences, de l'Agriculture et de génie Université de Newcastle, par l'Université d'Ulm, et par la SA SciMedia (Tokyo, Japon).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MiCAM02 | SciMedia | Imaging system | |
| BVAna v.10.08 | SciMedia | Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system | |
| HL-151 | Moritex, Tokyo, Japan | Ultra-low ripple halogen light source | |
| BX51 WI | Olympus Corporation | Upright microscope for epifluorescence imaging | |
| 20x imaging objective | Olympus Corporation | XLUMPLFL20XW/0.95 | NA 0.95, WD 2.0mm |
| 10x imaging objective | Olympus Corporation | UMPLFL10XW | NA 0.30, WD 3.3mm |
| Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter | Olympus Corporation | MSWG2 | |
| Antivibration table | Scientifica Ltd | 63-534 | |
| PatchStar electrode manipulator | Scientifica Ltd | PS-7000C | Micro-electrode manipulator |
| CED Power 1401 | Cambridge Electronic Design | Data acquisition board | |
| DL708E Oscilloscope | Yokogawa | Intracellular amplifier | |
| AC differential amplifier | University of Kaiserslautern, Germany | Extracellular amplifier | |
| P-97 Flaming – Brown type electrode puller | Sutter Instrument Co. | Electrode puller | |
| Sigma Microcentrifuge 1-14 | Sigma-Aldrich | Centrifuge | |
| Genex Pipettors Mline | Scientific Laboratory Supplies LTD | PIP7774 | PIP7774 |
| Glass micropipette with filament | Science Products | GB100TF 8P | Glass for micr–lectrodes |
| MicroFil – 34G | World Precision Instruments, Inc. | Microfil needle | |
| Spike 2 v6.10 | Cambridge Electronic Design | Electrophysiology software | |
| Di-8-ANEPPQ | Cambridge BioScience | BT61014 | Fluorescent voltage sensitive dye |
| F-127 Pluronic Acid, DMSO | Invitrogen | P-3000MP | Solvent |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Crab saline component |
| CaCl2 . 2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | Crab saline component |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | Crab saline component, electrolyte solution |
| MgCl2 . 6H2O | Sigma-Aldrich | M9272 | Crab saline component |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | Crab saline component |
| Maleic acid | Sigma-Aldrich | M0375 | Crab saline component |
| Elastosil RT-601 | Wacker, Munich, Germany | Lining of Petri dishes |
References
- Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Bartos, M., Nusbaum, M. P. Intercircuit control of motor pattern modulation by presynaptic inhibition. J. Neurosci. 17, 2247-2256 (1997).
- Blitz, D. M., Nusbaum, M. P. Motor pattern selection via inhibition of parallel pathways. J Neurosci. 17, 4965-4975 (1997).
- Stein, W., Smarandache, C. R., Nickmann, M., Hedrich, U. B. Functional consequences of activity-dependent synaptic enhancement at a crustacean neuromuscular junction. J Exp Biol. 209, 1285-12300 (2006).
- Loew, L. Potentiometric dyes: Imaging electrical activity of cell membranes. Pure & Appl Chem. 68, 1405-1409 (1996).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. J Neurosci Meth. 102, 11-23 (2000).
- Heinzel, H. G., Weimann, J. M., Marder, E. The behavioral repertoire of the gastric mill in the crab, Cancer pagurus: an in situ endoscopic and electrophysiological examination. J Neurosci. 13, 1793-1803 (1993).
- Zecevic, D., Wu, J. -Y., Cohen, L. B., London, J. A., Höpp, H. P., Falk, C. X. Hundreds of neurons in the Aplysia abdominal ganglion are active during the gill-withdrawal reflex. J Neurosci. 9, 3681-3689 (1989).
- Briggman, K. L., Kristan, W. B. Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors. J Neurosci. 26, 10925-10933 (2006).
- Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. A small-systems approach to motor pattern generation. Nature. 417, 343-350 (2002).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Ann Rev Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Grillner, S. Biological pattern generation: the cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52, 751-766 (2006).
- Yuste, R., MacLean, J. N., Smith, J., Lansner, A. The cortex as a central pattern generator. Nat Rev Neurosci. 6, 477-483 (2005).
- Stein, W. Modulation of stomatogastric rhythms. J Comp Physiol A. 195, 989-1009 (2009).
