Optisk avbildning av nervceller i Crab Stomatogastric Ganglion med spänningskänsliga Färgämnen

Summary

Här presenterar vi de metoder för snabb och hög upplösning fluorescerande spänningskänsliga färg avbildning av detaljerade aktivitet nervceller i krabba stomatogastric ganglion.

Abstract

Spänningskänsliga färg avbildning av nervceller är en viktig metod för förståelsen av hur neuronala nätverken är organiserade och hur den samtidiga aktivitet deltar nervceller leder till uppkomsten av den integrerade funktionaliteten i nätverket. Här presenterar vi de metoder för tillämpning av denna teknik för att identifiera mönster generera nervceller i krabba stomatogastric ganglion. Vi visar lastning av dessa nervceller med fluorescerande spänningskänsliga dye Di-8-ANEPPQ och vi visar hur bilden aktiviteten av färgämnet laddade nervceller med MiCAM02 hög hastighet och hög upplösning CCD-kameran Imaging System. Vi visar analysen av det inspelade bilddata med BVAna bildbehandlingsprogram samband med MiCAM02 Imaging System. Den samtidiga spänningskänsliga färg avbildning av den detaljerade aktiviteten av flera nervceller i krabba stomatogastric ganglion tillämpas tillsammans med traditionell elektrofysiologiska tekniker (intracellulära och extracellulära inspelningar) öppnar helt nya möjligheter för förståelsen av hur centrala mönsterritare neurala nätverk fungerar.

Protocol

1. Beredning av Crab Stomatogastric nervsystemet

Vuxen Cancer pagurus L. har erhållits från lokala källor (universitetet i Newcastle, Dove marina laboratorier) och förvaras i filtrerat, kolsyrat havsvatten (10 - 12 ° C). Djuren bedövas genom att packa dem i is i 20 - 40 min före dissekering. Vi använde isolerade stomatogastric nervsystemet (STNS) ^1. Den STNS var nålas ner i en silikon elastomer-fodrade (ELASTOSIL RT-601, Wacker München, Tyskland) petriskål och ständigt superfused (7 - 12 ml / min) med kylda koksaltlösning (10-13 ° C). Fysiologisk koksaltlösning bestod av (mmol * L-1): NaCl, 440, MgCl _2, 26, CaCl _2, 13, KCl, 11, trisma bas, 10, maleinsyra, 5. Saline låg kvar på en konstant temperatur av 11 - 13 ° C och vid pH 7,4 - 7,6.

De detaljerade stegen i STNS dissekering och förberedelser, inklusive desheathing av stomatoastric ganglion (STG), presenteras i Jové artikel av Guttierez och Grashow ^1. Alla experiment har utförts i enlighet med Europeiska gemenskapernas rådets direktiv av den 24 ^november 1986 (86/609/EEG). Figur 1A visar en schematisk bild av STNS och Figur 1B visar en typisk desheathed STG har sitt nervceller arrangeras som en platt halvcirkel i den bakre delen av ganglion.

Den petriskål med STNS fästs i operativ plattform för bildbehandling mikroskop (BW51 WI, Olympus, Tokyo, Japan) med modellera. Båda är de mikroskop scenen och mikroskopet monterat på en vibration isolerade bord (Scientifica, Uckfield, Storbritannien) för att förhindra rörelse artefakter under den optiska inspelningen. Motorn mönster som genereras i stomatogastric ganglion (STG) övervakas med hjälp extracellulära inspelningar ^2-4. Detta görs genom följande steg:

1. En vaselin-baserade cylindriska utrymmet är uppbyggd kring en del av huvudmotorn nerven (LVN) för att elektriskt isolera nerven från badet (detta görs på dissekering scenen innan petriskålen placeras på operativ plattform för bildbehandling mikroskop ).
2. En av två tråd av rostfritt stål elektrod placeras i detta fack, den andra i badet som referens elektrod.
3. Det differentiella signalen spelas in, filtreras och förstärks med en AC differentialförstärkare (Univ. Kaiserslautern, Tyskland).
4. Motorn aktivitet ganglion övervakas med hjälp av ett oscilloskop (DL708E, Yokogawa, Tokyo, Japan) och är dessutom in med ett datainsamlingssystem styrelse (CED Power, 1401, Cambridge Electronic Design, Cambridge, Storbritannien) och Spike 2 v6.10 programvara (Cambridge Electronic Design, Cambridge, Storbritannien). Filer analyseras med Spike 2 v6.10 (Cambridge Electronic Design, Cambridge, Storbritannien).

2. Beredning av färglösningen

Vi använde den fluorescerande spänningskänsliga dye Di-8-ANEPPQ (Cambridge Bioscience) ^5, som har en dubbel positiv laddning som underlättar lastning av färgen genom microelectrodes genom att använda positiv strömpulser. Färgen lösningen ska skyddas från ljus så mycket som möjligt. Färgen bereds enligt följande:

1. 5 mg färgämne blandas med 1 ml F-127 Pluronic syra i DMSO (Invitrogen) lösning.
2. Plasten injektionsflaskan med upplöst färg centrifugeras i 20 minuter vid 12 tusen rotation / minut i en Sigma mikrocentrifug 1-14 (Sigma, Osterode, Tyskland) för att avskilja större färgämne partiklar som kan täppa till mikroelektrod.
3. Supernatanten (topp 200 mikroliter) av färglösningen separeras med hjälp av en pipett och lagras i en separat plast flaska. Båda flaskorna är förpackade i aluminiumfolie för att förhindra exponering för ljus.
4. Färgen Lösningen är frysta vid -20 ° C.
5. Före användning färgen lösningen är smält genom att placera stängda och svepte flaskan i varmt (25 ° C) vatten i 10-15 minuter.

3. Dye Laddar av intracellulära Injektion enligt Sharps microelectrodes

Vi använde skarp microelectrodes att ladda nervceller med färgen. För att kontrollera färgen laddar vi använder MiCAM02 Imaging System (SciMedia, Tokyo, Japan) ^6. Det Imaging System har två CCD-kameror: HR-kameran har en större sensor chip (6,4 mm x 4,8 mm) ger bättre rumslig upplösning med de bästa temporala upplösningen är 1,4 ms, har HS kameran en mindre (2,9 mm x 2,1 mm) men snabbare Sensorchipet möjliggör snabbare bildhantering ha 0,7 ms som sin bästa temporal upplösning. De olika stegen i färgen lastningen är följande:

1. Microelectrodes dras med en P-97 Flaming - Brun (Sutter Instrument, Novato, CA, USA) elektrod avdragare med 10 cm långa, 1 mm ytterdiameter provrör av glas med glödtråd (GB100TF 8P, Science Produkter, Hofheim, Tyskland). Elektroderna dras att ha ett motstånd iutbud av 25 till 40 MOhm i 3M KCl (för lämpliga dra parameterinställningar följa pipetten kokbok tillhandahålls av tillverkaren av elektroden avdragare).
2. Den frysta färglösningen är smält och en mycket liten mängd av det sugs upp i en microfil nål (MicroFil - 34g, Världen precisionsinstrument, Sarasota, FL, USA) - de sög upp färgen fyller cirka 2 / ^{3: e} av microfil nål .
3. Den färglösningen i microfil nål sprutas in i toppen av en mikroelektrod. Den mikroelektrod placeras i en mörk låda i 15 minuter.
4. Den mikroelektrod är återfylls med 3M KCl-lösning. Elektroden placeras sedan tillbaka i en mörk elektrod förvaringsbox i ytterligare 10-20 minuter så att färgen lösningen för att nå den fina spetsen på elektroden genom sugning av kapillärkraften agerar i mikroelektrod.
5. Den färdiga mikroelektrod placeras i en elektrodhållare och fast på headstage av intracellulära förstärkare (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, USA).
6. Den intracellulära förstärkare är ansluten till datainsamling styrelse som ger en puls signal att köra strömpulser i mikroelektrod.
7. Den mikroelektrod placeras försiktigt i membranet i en STG neuron med hjälp av en mikroelektrod manipulator (PatchStar, Scientifica Ltd, Uckfield, Storbritannien). Eftersom arbetsgruppen avstånd 10x objektiv (UMPLFL10XW, NA 0,30, WD 3.3mm, Olympus Corporation, Tokyo, Japan) av imaging mikroskopet är mycket liten, bör mikroelektrod placeras i en sned ställning (ca 30 °) och rörelsen av mikroelektrod i rätt läge kräver flera steg av ny inriktning av mikroskopet mål och flytta mikroelektrod. För att starta mikroelektrod flyttas i en position så att dess spets ligger över STG. Mikroskopet Målet är sänkt tills elektrodspetsen visas i fokus. Då är det sänkas ytterligare, men inte lika mycket att röra mikroelektrod. Den mikroelektrod sänks tills den visas på nytt i fokus för målet. Dessa steg upprepas tills nervceller visas tydligt i fokus planet av målet. Då mikroelektrod sänks tills det når och försiktigt tränger membranet i den valda STG neuron. Detta övervakas med hjälp av oscilloskopet.
8. Den intracellulära elektrod används för att registrera aktiviteten av de utvalda STG neuron i syfte att identifiera de neuron med tanke på dess aktiviteter profil och förhållandet mellan dess verksamhet och STG som registrerats från extracellulära elektroden ^2,3,7.
9. Den intracellulära förstärkaren är påslagen i aktuella injektion läget och används i 30 minuter att injicera 10 nA positiva aktuella stegen i mikroelektrod som varar i 1 sekund och avgränsas med 1 sekund luckor ingen aktuell injiceras i mikroelektrod. Den injicerade nuvarande driver positivt laddade färgen molekyler i den inspelade neuron. Om utrustning finns flera nervceller kan injiceras samtidigt.
10. Tio minuter in i injektionen perioden och efter injektionen färgen sprids inom neuron är markerad. För att göra detta använder vi MiCAM02 Imaging System (SciMedia Ltd, Tokyo, Japan) med 10x objektiv och belysning av de ultra-lågt rippel halogen ljuskälla (HL-151, Moritex, Tokyo, Japan) genom filtret kub MSWG2 (med 480-550 nm excitation filter, Olympus Corporation, Tokyo, Japan). Det Imaging System är inställd på att använda HR-kamera med 192 x 128 pixlars upplösning, 40 ms avbildning tid, "hbin"-läge och 10 bilder per avbildning session. Om färgen fyllningen är framgångsrik avbildning ska visa ett färgat plåster i neuron runt platsen för mikroelektrod, och detta färgade Plåstret ska växa mellan de bilder som tagits efter 10 minuter och efter 30 minuter. Om spridningen av färgen är otillräcklig efter 30 min, är mer injektion tid beviljas. Alternativt kan en ny färg elektrod användas.
11. Elektroden dras ut av neuron och neuron är kvar att slappna av i minst 20-30 minuter. Inom denna tid, kan nästa neuron injiceras med färgämne.

4. Imaging av färgade Neuroner

Aktiviteten av den inre nervceller kan avbildas efter färgen påfyllningsförfarandet. Alternativt två eller fler nervceller kan fyllas till bilden samtidigt aktiviteten av flera STG nervceller. I princip många och kanske alla STG nervceller kan fyllas med färg. Den avbildning av nervceller sker med MiCAM 02 imaging system med hjälp av HR-kameran. Förfarandet för avbildning är följande:

1. Mikroskopet mål ändras och en hög ljustransmission verkningsgrad 20x objektiv (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0,95, WD 2,0 mm, Olympus Corporation, Tokyo, Japan) används för att avbilda datainsamling. Detta mål samlar in mycket mer ljus att 10x objektiv och ger också högre förstoring ger mer detaljerad bild av nervceller. Bein g mer ljus effektivare innebär att mindre mängd färg lastning är redan synligt med detta mål, och också att vi kan använda lägre ljusintensitet för bildbehandling minskar risken fotot skador som kan uppstå på nervceller som färgämne.
2. Mikroskopet operativa skedet är placerad så att de nervceller som är tänkta att vara avbildas är i synfältet av målet och målet är fokuserat på dem.
3. Den extracellulära spela in data är också matas in i MiCAM 02 Imaging System genom sina analoga ingången kanal. Detta gör att relativt enkelt rör av optiska signaler och motsvarande mönster motor eller extracellularly in spikar i analysfasen.
4. Det MiCAM 02 är inställd på att använda 96 x 64 pixlar med 2,2 ms avbildning tid eller 48 x 32 pixlar med 1,5 ms avbildning tid. I båda fallen "hbin" inställning kan användas om färgning av nervceller är inte särskilt stark.
5. Ljuset är satt så lågt som möjligt (dvs. färgen i nervceller ska generera fortfarande tillräckligt fluorescens för att avbilda) för att undvika foto modulering och foto skada av det inspelade nervceller.
6. Belysningen i rummet och alla kvarvarande ljuskällor är avstängda. Dessutom kan en svart gardin stängas kring inspelningen riggen för att förhindra att ljus exponering från externa källor.
7. Den avbildning sessioner är inställda på att vara mellan 4 - 16 sekunder lång.
8. Den spontana aktiviteten av färgade nervceller spelas in under flera avbildning sessioner.

5. Analys av optisk avbildning Data

Att analysera bilddata vi använt BVAna (version 10,08, SciMedia Ltd, Tokyo, Japan) i samband med MiCAM 02 Imaging System. Programvaran stöder visualisering av bilddata och erbjuder en rad analysverktyg också. Stegen av data analys och tolkning är följande:

1. En lämplig cirkulär region av intresse väljs på varje inspelad nervceller. Vanligtvis använder vi 2 till 3 regioner pixel radie av intresse för att undersöka nervceller på 48 x 32 pixlar, och 6 till 8 pixel radie områden av intresse för undersökning av nervceller på 96 x 64 upplösning.
2. Den tidsmässiga utjämning av data kan vara nödvändig, särskilt om färgen genererar relativt liten mängd fluorescens (lågt bakgrunden värde i data indikerar detta, det kan bero på den låga ljusnivån som används eller låg nivå färg lastning, till exempel i en neurite av de registrerade neuron). Vanligtvis i sådana fall använde vi temporal utjämning med 3 - 5 gånger enheter.
3. Förutom den optiska inspelningar visar vi också den extracellulära inspelningen genom att välja att visa den analoga ingången av Imaging System.
4. Parametrarna för visualisering av optiska data och analog ingång bör fastställas på lämpligt sätt för att se alla inspelningar på datorskärmen.
5. Med tanke på den optiska inspelningar av nervceller, den extracellulära inspelning från LVN, och klassificeringen av neuron som bygger på tidigare intracellulära inspelningen, är det möjligt att fastställa identiteten av neuron och att relatera sin verksamhet till de neurala aktiviteter som spelats in från nerv.
6. Det förväntas att den optiska inspelningar visar tydligt, och utan behov av genomsnitt över flera liknande händelser, neurala aktiviteter motsvarande extracellularly in spikar och även händelser subthreshold som hämmande postsynaptiska potentialer orsakade av aktiviteten hos andra nervceller.
7. Uppgifterna export funktioner i BVAna programvara kan användas för att exportera den optiska inspelningarna beräknas för de utvalda regionerna av intresse och även analog ingång som innehåller inspelning från LVN. Den exporterade data kan bearbetas och analyseras vidare med hjälp av andra dataanalys programvara samt (t.ex. i det enklaste fallet Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) kan användas för ytterligare visualisering och databehandling).

6. Representativa resultat

Figur 2 visar samtidig inspelning av två nervceller (LP, laterala pyloric neuron, PD, pyloric dilator neuron) i pyloric centrala mönsterritare av en krabba STG tillsammans med inspelning från LVN. Den optiska inspelningar av LP och PD nervceller som identifierats på grundval av deras intracellulära inspelningar visar att verkligen dessa stämmer väl överens med den extracellulära inspelningar motsvarande LP och PD nervceller. Det finns en konsekvent 12 ms fördröjning mellan optisk och LVN inspelningar av spik toppar (se infällda i figur 2) på grund av axonal Tidsgränsen mellan ganglion och extracellulära inspelningen sajten. De data som presenteras visar även att neural aktivitet i Soma som motsvarar spikar på den inspelade nervceller klart kan spåras.

s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg "alt =" Bild 1 "/>
Figur 1. A) Schematisk beskrivning av stomatogastric nervsystemet (STNS). Cog, commissural ganglion, OG, esofageal ganglion, STG, stomatogastric ganglion, STN, stomatogastric nerv, LVN, lateral ventrikulär nerv. B) krabba stomatogastric ganglion (STG) - bilden visar den halvcirkelformade bakre arrangemang av STG nervceller.

Figur 2. Samtidig enda svep inspelning av en PD och en LP-neuron tillsammans med inspelning av LVN. Uppgifterna visar att att den optiska och nerv inspelningar matchen mycket bra och att vi kan identifiera de neurala aktiviteter motsvarande spikar inspelad form nerven. Den infällda bilden visar en överlagring av flera svep av LP aktionspotentialer - både optiskt och elektriskt inspelade - och deras genomsnittliga visar matchen mellan optiskt och elektriskt inspelade aktiviteter. På grund av det faktum att vår optisk inspelning metoden inte filtrera bort de lågfrekventa komponenterna i de data vi har även möjlighet att spela in långsamma förändringar membranpotential karaktäristiska för PD och LP nervceller ^14.

Discussion

Spänningen känsliga färga avbildning ^8,9 av STG nervceller i kombination med traditionella elektrofysiologiska metoder (intra-och extracellulära elektrod inspelningar) ger en ökad förståelse för hur denna lilla, välkända och fortfarande komplexa neurala systemet fungerar. Den STG är en prototyp av central (CPG) laserritare neuronala nätverk (det inkluderar pyloric och mag-nät kvarn rytm) ^{10,, 11,} och därmed en bättre förståelse av den framväxande funktionella egenskaper STG kommer också att hjälpa till att förstå hur i allmänhet CPG nätverk genererar deras funktionalitet nätverksnivå. CPG nätverk spelar en avgörande roll i motorisk kontroll ¹² och även i högre kognitiva funktioner ^13, därmed bättre förståelse för deras emergenta egenskaper kan få stor betydelse inom många områden i neurovetenskap.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MiCAM02	SciMedia		Imaging system
BVAna v.10.08	SciMedia		Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system
HL-151	Moritex, Tokyo, Japan		Ultra-low ripple halogen light source
BX51 WI	Olympus Corporation		Upright microscope for epifluorescence imaging
20x imaging objective	Olympus Corporation	XLUMPLFL20XW/0.95	NA 0.95, WD 2.0mm
10x imaging objective	Olympus Corporation	UMPLFL10XW	NA 0.30, WD 3.3mm
Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter	Olympus Corporation	MSWG2
Antivibration table	Scientifica Ltd	63-534
PatchStar electrode manipulator	Scientifica Ltd	PS-7000C	Micro-electrode manipulator
CED Power 1401	Cambridge Electronic Design		Data acquisition board
DL708E Oscilloscope	Yokogawa		Intracellular amplifier
AC differential amplifier	University of Kaiserslautern, Germany		Extracellular amplifier
P-97 Flaming – Brown type electrode puller	Sutter Instrument Co.		Electrode puller
Sigma Microcentrifuge 1-14	Sigma-Aldrich		Centrifuge
Genex Pipettors Mline	Scientific Laboratory Supplies LTD	PIP7774	PIP7774
Glass micropipette with filament	Science Products	GB100TF 8P	Glass for micr–lectrodes
MicroFil – 34G	World Precision Instruments, Inc.		Microfil needle
Spike 2 v6.10	Cambridge Electronic Design		Electrophysiology software
Di-8-ANEPPQ	Cambridge BioScience	BT61014	Fluorescent voltage sensitive dye
F-127 Pluronic Acid, DMSO	Invitrogen	P-3000MP	Solvent
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Crab saline component
CaCl2 . 2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	Crab saline component
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	Crab saline component, electrolyte solution
MgCl2 . 6H2O	Sigma-Aldrich	M9272	Crab saline component
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503	Crab saline component
Maleic acid	Sigma-Aldrich	M0375	Crab saline component
Elastosil RT-601	Wacker, Munich, Germany		Lining of Petri dishes