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Neuroscience

वोल्ट के प्रति संवेदनशील रंगों के साथ केकड़े Stomatogastric नाड़ीग्रन्थि में न्यूरॉन्स के ऑप्टिकल इमेजिंग

doi: 10.3791/2567 Published: March 23, 2011

Summary

यहाँ हम तेजी से और उच्च संकल्प फ्लोरोसेंट केकड़ा stomatogastric नाड़ीग्रन्थि में न्यूरॉन्स की विस्तृत गतिविधि के वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई इमेजिंग के लिए पद्धति प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

वोल्ट के प्रति संवेदनशील न्यूरॉन्स की डाई इमेजिंग कैसे neuronal नेटवर्क का आयोजन कर रहे हैं समझने के लिए एक महत्वपूर्ण पद्धति है और कैसे भाग लेने वाले न्यूरॉन्स के साथ - साथ गतिविधि नेटवर्क का अभिन्न कार्यक्षमता के उद्भव के लिए सुराग. यहाँ हम पहचान केकड़ा stomatogastric नाड़ीग्रन्थि में पैटर्न पैदा न्यूरॉन्स के लिए इस तकनीक के आवेदन की पद्धति मौजूद है. हम फ्लोरोसेंट वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई डि - 8 ANEPPQ के साथ इन न्यूरॉन्स की लोडिंग प्रदर्शन और हम बताते हैं कैसे डाई लोड MiCAM02 उच्च गति और उच्च संकल्प सीसीडी कैमरा इमेजिंग प्रणाली का उपयोग न्यूरॉन्स की गतिविधियों की छवि. हम दर्ज इमेजिंग BVAna इमेजिंग MiCAM02 इमेजिंग प्रणाली के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण प्रदर्शित करता है. युगपत वोल्टेज के प्रति संवेदनशील केकड़ा stomatogastric नाड़ीग्रन्थि में कई न्यूरॉन्स की विस्तृत गतिविधि की डाई इमेजिंग पारंपरिक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी तकनीक (intracellular और बाह्य रिकॉर्डिंग) मौलिक केंद्रीय पैटर्न कैसे जनरेटर तंत्रिका नेटवर्क काम की समझ के लिए नए अवसरों को खोलता के साथ एक साथ लागू होता है.

Protocol

1. केकड़े Stomatogastric तंत्रिका तंत्र की तैयारी

प्रौढ़ कैंसर pagurus एल (न्यूकासल विश्वविद्यालय, समुद्री प्रयोगशालाओं कबूतर) स्थानीय स्रोतों से प्राप्त किया गया और फ़िल्टर, वातित समुद्री जल में रखा (10 - 12 डिग्री सेल्सियस). विच्छेदन के 40 मिनट पहले - पशु उन्हें बर्फ में 20 के लिए पैकिंग द्वारा anesthetized थे. हम अलग stomatogastric नर्वस सिस्टम (STNS) 1 इस्तेमाल किया. STNS एक सिलिकॉन elastomer लाइन (ELASTOSIL RT-601, Wacker, म्यूनिख, जर्मनी) पेट्री डिश में नीचे टिकी किया गया था और लगातार superfused (7 - 12 एमएल मिनट /) ठंडा खारा (10-13 डिग्री सेल्सियस) के साथ. , 2 MgCl, 26, 2 CaCl, 13, KCl, 11, trisma आधार, 10, Maleic एसिड, 5 NaCl, 440: शारीरिक खारा (* l-1 mmol) के शामिल. 13 डिग्री सेल्सियस और 7.4 पीएच - 7.6 खारा 11 का एक निरंतर तापमान पर रखा गया था.

STNS विच्छेदन और तैयारी की विस्तृत कदम, stomatoastric नाड़ीग्रन्थि (STG) के desheathing सहित, Guttierez और Grashow 1 द्वारा जौव लेख में प्रस्तुत कर रहे हैं. सभी प्रयोगों में किए गए 24 वें नवम्बर 1986 (86/609/EEC) के यूरोपीय समुदाय काउंसिल डायरेक्टिव के अनुसार. चित्रा 1A STNS और चित्रा 1 बी के एक योजनाबद्ध आरेख से पता चलता है एक ठेठ desheathed अपने न्यूरॉन्स नाड़ीग्रन्थि के पीछे भाग में एक फ्लैट अर्धवृत्त के रूप में व्यवस्थित होने STG से पता चलता है.

क्ले मॉडलिंग के साथ, STNS साथ पेट्री डिश इमेजिंग खुर्दबीन के संचालन मंच (ओलिंप, टोक्यो, जापान BW51 WI) के लिए तय हो गई है. दोनों खुर्दबीन मंच और माइक्रोस्कोप एक कंपन अलग मेज पर बढ़ रहे हैं (Scientifica, Uckfield, ब्रिटेन) ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के दौरान आंदोलन कलाकृतियों को रोकने. मोटर stomatogastric नाड़ीग्रन्थि (STG) में उत्पन्न पैटर्न कोशिकी 2-4 रिकॉर्डिंग का उपयोग करने के लिए निगरानी कर रहे हैं. यह निम्नलिखित चरणों के माध्यम से किया जाता है:

  1. एक पेट्रोलियम जेली - आधारित बेलनाकार डिब्बे मुख्य मोटर (LVN) तंत्रिका विद्युत स्नान से तंत्रिका (इस विच्छेदन मंच पर किया जाता है इससे पहले कि पेट्री डिश इमेजिंग खुर्दबीन के संचालन मंच पर रखा गया है अलग के एक खंड के चारों ओर बनाया गया है ).
  2. दो स्टेनलेस स्टील इलेक्ट्रोड तारों के इस डिब्बे में रखा गया है, एक संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में स्नान में एक दूसरे.
  3. अंतर संकेत दर्ज की है, फ़िल्टर्ड है और एक एसी अंतर प्रवर्धक (Univ. Kaiserslautern, जर्मनी) के साथ प्रवर्धित.
  4. नाड़ीग्रन्थि की मोटर गतिविधि एक आस्टसीलस्कप (DL708E, Yokogawa, टोक्यो, जापान) का उपयोग करते हुए नजर रखी है और इसके अलावा एक डाटा अधिग्रहण बोर्ड (CED पावर, 1401, कैम्ब्रिज इलेक्ट्रॉनिक डिजाइन, कैम्ब्रिज, ब्रिटेन) और 2 v6.10 स्पाईक का उपयोग कर दर्ज सॉफ्टवेयर (कैम्ब्रिज इलेक्ट्रॉनिक डिजाइन, कैंब्रिज, ब्रिटेन). फ़ाइलें 2 स्पाईक v6.10 (कैम्ब्रिज इलेक्ट्रॉनिक डिजाइन, कैंब्रिज, ब्रिटेन) का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं.

2. डाई समाधान की तैयारी

हम फ्लोरोसेंट वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई (बायोसाइंस कैम्ब्रिज) डि - 8 ANEPPQ 5, जो एक डबल सकारात्मक आरोप है कि सकारात्मक वर्तमान दालों का उपयोग करके microelectrodes के माध्यम से डाई की लोडिंग की सुविधा का इस्तेमाल किया . डाई समाधान जितना संभव प्रकाश से रक्षा की जानी चाहिए. डाई समाधान के रूप में तैयार किया गया है:

  1. डाई की 5 मिलीग्राम 1 एफ 127 DMSO समाधान (Invitrogen) में Pluronic एसिड की एमएल के साथ मिलाया जाता है.
  2. भंग डाई युक्त प्लास्टिक की शीशी 20 मिनट के लिए 12,000 पर centrifuged रोटेशन / सिग्मा 14/01 Microcentrifuge मिनट में (सिग्मा, Osterode, जर्मनी) के क्रम में बड़ा डाई कणों कि microelectrode रोकना हो सकता है अलग.
  3. सतह पर तैरनेवाला डाई समाधान के (शीर्ष 200 μL) एक pipettor का उपयोग अलग है और एक अलग प्लास्टिक की शीशी में संग्रहित है. दोनों शीशियों एल्यूमीनियम के लिए प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने पन्नी में लिपटे रहे हैं.
  4. डाई समाधान -20 ° सी. पर जमे हुए है
  5. इससे पहले कि डाई समाधान का उपयोग करें गर्म (25 डिग्री सेल्सियस) पानी में 10-15 मिनट के लिए बंद कर दिया और लिपटे शीशी रखकर पिघला है.

3. Intracellular तीव्र microelectrodes का उपयोग इंजेक्शन द्वारा डाई लोड हो रहा है

हम तेज microelectrodes इस्तेमाल डाई के साथ न्यूरॉन्स लोड. डाई लोडिंग की जांच हम MiCAM02 इमेजिंग प्रणाली (SciMedia, टोक्यो, जापान) 6 का उपयोग करने के लिए. इमेजिंग प्रणाली दो सीसीडी कैमरों है: मानव संसाधन कैमरा एक बड़ा सेंसर चिप (6.4 मिमी x 4.8 मिमी) सबसे अच्छा अस्थायी 1.4 एमएस जा रहा है संकल्प के साथ बेहतर स्थानिक संकल्प प्रदान, एच एस कैमरा एक छोटे (2.9 मिमी x 2.1 मिमी) है, लेकिन तेजी से सेंसर तेजी से अपने सबसे अच्छा अस्थायी समाधान के रूप में 0.7 एमएस होने इमेजिंग की अनुमति चिप. डाई लोडिंग के कदम निम्नानुसार हैं:

  1. Microelectrodes के साथ खींच रहे हैं एक पी-97 ज्वलंत - ब्राउन (Sutter उपकरण, Novato, CA, संयुक्त राज्य अमरीका) इलेक्ट्रोड 10 सेमी लंबे समय का उपयोग खींचने, 1 मिमी रेशा (GB100TF 8P, विज्ञान उत्पाद, Hofheim, जर्मनी) के साथ बाहरी व्यास ग्लास ट्यूब. इलेक्ट्रोड में एक प्रतिरोध है खींच रहे हैं25 की सीमा - 3M KCl में 40 MOhm (के लिए उपयुक्त खींच पैरामीटर सेटिंग्स विंदुक इलेक्ट्रोड खींचने के निर्माता द्वारा प्रदान की रसोई की किताब का पालन करें).
  2. जमी डाई समाधान पिघला हुआ है और यह की एक बहुत छोटी राशि एक microfil (MicroFil - 34g, विश्व परिशुद्धता उपकरण, Sarasota, FL, संयुक्त राज्य अमरीका) - सुई में चूसा है शोषित डाई microfil सुई के 2 / 3 के आसपास भरता .
  3. microfil सुई में डाई समाधान microelectrode की नोक में अंतःक्षिप्त है. microelectrode 15 मिनट के लिए एक काले बॉक्स में रखा गया है.
  4. microelectrode 3M KCl समाधान के साथ backfilled है. इलेक्ट्रोड तो एक अंधेरे इलेक्ट्रोड भंडारण बॉक्स में एक और 10-20 मिनट के लिए वापस डाई समाधान केशिका बल microelectrode में अभिनय के चूषण द्वारा इलेक्ट्रोड के ठीक टिप तक पहुँचने की अनुमति नहीं रखा गया है.
  5. तैयार microelectrode एक इलेक्ट्रोड धारक में रखा है और intracellular एम्पलीफायर के headstage (IA-251A, वार्नर उपकरण निगम, Hamden, सीटी, संयुक्त राज्य अमरीका) पर निर्धारित है.
  6. intracellular प्रवर्धक डाटा अधिग्रहण बोर्ड है कि एक पल्स संकेत microelectrode में वर्तमान दालों ड्राइव प्रदान करता है से जुड़ा है.
  7. microelectrode धीरे एक STG microelectrode जोड़तोड़ (PatchStar, Scientifica लिमिटेड, Uckfield, ब्रिटेन) का उपयोग न्यूरॉन की झिल्ली में रखा गया है. चूंकि 10x उद्देश्य के काम (UMPLFL10XW, 0.30 एनए, WD 3.3mm, ओलिंप निगम, टोक्यो, जापान) इमेजिंग खुर्दबीन की दूरी बहुत छोटी है, microelectrode एक तिरछा स्थिति में तैनात किया जाना चाहिए (30 डिग्री के आसपास) और आंदोलन सही स्थिति में microelectrode की खुर्दबीन उद्देश्य के फिर से ध्यान केंद्रित है और आगे बढ़ microelectrode के कई कदम की आवश्यकता है. एक ऐसी है कि इसकी टिप STG ऊपर है स्थिति में microelectrode शुरू करने के लिए ले जाया जाता है. खुर्दबीन उद्देश्य इलेक्ट्रोड टिप तक ध्यान में प्रकट होता है कम है. तो इसे आगे भी कम है, लेकिन microelectrode स्पर्श के रूप में बहुत ज्यादा नहीं. microelectrode जब तक यह उद्देश्य ध्यान में फिर से प्रकट होता है कम है. इन चरणों तक न्यूरॉन्स उद्देश्य का ध्यान केंद्रित विमान में स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं दोहराया जाता है. फिर microelectrode जब तक यह छू लेती है और धीरे चयनित STG न्यूरॉन झिल्ली pierces उतारा है. इस आस्टसीलस्कप का उपयोग पर नजर रखी है.
  8. intracellular इलेक्ट्रोड चयनित STG न्यूरॉन गतिविधि रिकॉर्ड के क्रम में अपनी गतिविधि प्रोफ़ाइल और अपनी गतिविधि और गतिविधि कोशिकी 2,3,7 इलेक्ट्रोड से दर्ज STG के बीच के रिश्ते दिया न्यूरॉन की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है.
  9. intracellular प्रवर्धक वर्तमान इंजेक्शन मोड में बंद है और 30 मिनट के लिए प्रयोग किया जाता microelectrode है कि 1 सेकंड के लिए पिछले और 1 सेकंड अंतराल द्वारा microelectrode में कोई मौजूदा इंजेक्शन के साथ अलग कर रहे हैं में सकारात्मक वर्तमान कदम NA 10 इंजेक्षन. दर्ज न्यूरॉन में इंजेक्शन वर्तमान सकारात्मक आरोप लगाया डाई अणु ड्राइव. यदि उपकरण उपलब्ध है एक साथ कई न्यूरॉन्स इंजेक्शन जा सकता है.
  10. इंजेक्शन अवधि में और इंजेक्शन के अंत के बाद दस मिनट के न्यूरॉन के भीतर डाई प्रसार की जाँच की है. फिल्टर क्यूब MSWG2 के माध्यम से (के साथ, ऐसा करने के लिए हम 10x उद्देश्य और अल्ट्रा कम तरंग हलोजन प्रकाश स्रोत (Moritex, टोक्यो, जापान HL-151) द्वारा रोशनी के साथ MiCAM02 इमेजिंग प्रणाली (SciMedia लिमिटेड, टोक्यो, जापान) का उपयोग करें 480-550 एनएम उत्तेजना फिल्टर, ओलिंप निगम, टोक्यो, जापान). इमेजिंग प्रणाली के लिए 192 x 128 पिक्सेल संकल्प, 40 एमएस इमेजिंग समय, 'hbin' मोड, और इमेजिंग सत्र प्रति 10 तख्ते के साथ मानव संसाधन कैमरे का उपयोग करने के लिए सेट कर दिया जाता है. यदि डाई भरने सफल है इमेजिंग microelectrode के स्थान के आसपास के न्यूरॉन में एक रंगे पैच दिखाने के लिए, जाना चाहिए और इस रंगे पैच 10 मिनट के बाद और 30 मिनट के बाद लिया छवियों के बीच हो जाना चाहिए. यदि डाई के प्रसार 30 मिनट के बाद अपर्याप्त है, और अधिक इंजेक्शन समय दिया है. वैकल्पिक रूप से, एक नए डाई इलेक्ट्रोड इस्तेमाल किया जा सकता है.
  11. इलेक्ट्रोड न्यूरॉन के बाहर खींच लिया है और न्यूरॉन के लिए कम से कम 20-30 मिनट के लिए आराम करने के लिए छोड़ दिया है. इस समय के भीतर, अगले न्यूरॉन डाई के इंजेक्शन के साथ हो सकता है.

4. रंगे न्यूरॉन्स की इमेजिंग

एकल न्यूरॉन्स की गतिविधियों डाई भरने की प्रक्रिया के बाद imaged किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से दो या दो से अधिक न्यूरॉन्स छवि को भरा जा सकता है कई STG न्यूरॉन्स की एक साथ गतिविधि. सिद्धांत रूप में कई और संभवतः सभी STG न्यूरॉन्स डाई से भरा जा सकता है. न्यूरॉन्स की इमेजिंग MiCAM 02 इमेजिंग एचआर कैमरे का उपयोग कर प्रणाली के साथ किया है. इमेजिंग की प्रक्रिया निम्नानुसार है:

  1. खुर्दबीन उद्देश्य बदल गया है और एक उच्च प्रकाश संचरण दक्षता 20x उद्देश्य (XLUMPLFL20XW/0.95, 0.95 एनए, WD 2.0mm, ओलिंप निगम, टोक्यो, जापान) इमेजिंग डेटा संग्रह के लिए प्रयोग किया जाता है. इस उद्देश्य अधिक प्रकाश इकट्ठा है कि 10x उद्देश्य और भी अधिक बढ़ाई देता है न्यूरॉन्स की अधिक विस्तृत छवि प्रदान. बेन छ अधिक प्रकाश कुशल मतलब है कि डाई लोड हो रहा है की एक छोटी राशि पहले से ही इस उद्देश्य और भी है कि हम इमेजिंग कि डाई द्वारा न्यूरॉन्स के लिए कारण हो सकता है संभावित तस्वीर क्षति को कम करने के लिए कम प्रकाश की तीव्रता का उपयोग कर सकते हैं के साथ दिखाई है.
  2. खुर्दबीन ऑपरेटिंग चरण ऐसी है कि न्यूरॉन्स कि imaged किया जा होती हैं उद्देश्य के दृश्य के क्षेत्र में हैं और उद्देश्य उन पर ध्यान केंद्रित है तैनात है.
  3. कोशिकी रिकॉर्डिंग डेटा भी अपने एनालॉग इनपुट चैनल के माध्यम से MiCAM 02 इमेजिंग प्रणाली में खिलाया है. यह अपेक्षाकृत आसान ऑप्टिकल संकेतों और इसी मोटर पैटर्न या extracellularly दर्ज spikes के विश्लेषण चरण में संबंधित की अनुमति देता है.
  4. MiCAM 02 प्रणाली को 2.2 एमएस इमेजिंग समय या 48 x 32 पिक्सेल संकल्प के साथ 1.5 एमएस इमेजिंग समय के साथ 96 x 64 पिक्सेल संकल्प का उपयोग करने के लिए सेट कर दिया जाता है. दोनों ही मामलों में अगर न्यूरॉन्स की रंगाई बहुत मजबूत नहीं है 'hbin' सेटिंग में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  5. प्रकाश के स्तर के रूप में सेट कर दिया जाता है संभव के रूप में कम है (यानी न्यूरॉन्स में डाई अभी भी इमेजिंग के लिए पर्याप्त प्रतिदीप्ति उत्पन्न चाहिए) फोटो मॉडुलन और दर्ज न्यूरॉन्स की तस्वीर नुकसान से बचने के लिए.
  6. कमरे प्रकाश और सभी शेष प्रकाश स्रोतों से बदल रहे हैं. इसके अलावा, एक काले पर्दे रिकॉर्डिंग रिग के आसपास बंद हो सकता है बाहरी स्रोतों से प्रकाश प्रदर्शन को रोकने के.
  7. 16 सेकंड लंबे - इमेजिंग सत्र 4 के बीच सेट कर रहे हैं.
  8. रंगे न्यूरॉन्स की सहज गतिविधि कई इमेजिंग सत्र पर दर्ज की गई है.

5. ऑप्टिकल इमेजिंग डेटा का विश्लेषण

MiCAM 02 इमेजिंग प्रणाली के साथ जुड़े; इमेजिंग डेटा का विश्लेषण करने के लिए हम BVAna (10.08 संस्करण SciMedia लिमिटेड, टोक्यो, जापान) सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया. सॉफ्टवेयर इमेजिंग डेटा के दृश्य का समर्थन करता है और विश्लेषण उपकरणों की एक श्रृंखला के रूप में अच्छी तरह से प्रदान करता है. डेटा विश्लेषण और व्याख्या के इस कदम निम्नानुसार हैं:

  1. प्रत्येक दर्ज न्यूरॉन्स पर ब्याज की एक उचित परिपत्र क्षेत्र चयनित होता है. आमतौर पर हम 2 का उपयोग करें - 48 x 32 पिक्सेल संकल्प में न्यूरॉन्स, और 6 की जांच के लिए 3 पिक्सेल ब्याज की त्रिज्या क्षेत्रों - 96 x 64 संकल्प में न्यूरॉन्स की जांच के लिए 8 पिक्सेल ब्याज की त्रिज्या क्षेत्रों.
  2. डेटा के अस्थायी चौरसाई के लिए आवश्यक हो सकता है, खासकर अगर डाई प्रतिदीप्ति (डेटा में कम पृष्ठभूमि मूल्य अपेक्षाकृत कम राशि उत्पन्न यह इंगित करता है हो सकता है, यह कम प्रकाश के स्तर पर है कि प्रयोग किया जाता है या कम स्तर डाई लोड हो रहा है कारण हो सकता है उदाहरण के लिए, दर्ज न्यूरॉन के एक neurite में). ऐसे मामलों में आमतौर पर हम 3 के साथ अस्थायी चौरसाई का इस्तेमाल किया - 5 समय इकाइयों.
  3. ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के अलावा हम भी कोशिकी रिकॉर्डिंग के लिए इमेजिंग प्रणाली के अनुरूप इनपुट प्रदर्शन का चयन करके प्रदर्शित करते हैं.
  4. डेटा ऑप्टिकल और एनालॉग इनपुट के दृश्य के लिए पैरामीटर उचित सेट किया जाना चाहिए क्रम में के लिए कंप्यूटर स्क्रीन पर सभी रिकॉर्डिंग देखने.
  5. न्यूरॉन्स, LVN से कोशिकी रिकॉर्डिंग, और पहले intracellular रिकॉर्डिंग के आधार पर न्यूरॉन के वर्गीकरण के ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग को ध्यान में रखते हुए, यह संभव है न्यूरॉन की पहचान का निर्धारण करने के लिए और तंत्रिका से दर्ज की गतिविधियों के लिए अपनी गतिविधि से संबंधित तंत्रिका.
  6. यह उम्मीद है कि ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग स्पष्ट रूप से दिखाने के लिए, और कई इसी तरह की घटनाओं, तंत्रिका extracellularly दर्ज spikes और भी निरोधात्मक बाद synaptic अन्य न्यूरॉन्स की गतिविधियों से कारण क्षमता जैसे subthreshold घटनाओं इसी गतिविधियों से अधिक औसत की जरूरत के बिना.
  7. BVAna सॉफ्टवेयर का डेटा निर्यात सुविधाओं के हित के चयनित क्षेत्रों और एनालॉग इनपुट जिसमें LVN से रिकॉर्डिंग के लिए गणना करने के लिए ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग निर्यात के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. निर्यातित आंकडे और संसाधित किया जा सकता है विश्लेषण और अन्य डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के रूप में अच्छी तरह से (जैसे Microsoft Excel (माइक्रोसॉफ्ट, रेडमंड, WA, अमेरिका) सरल मामले में अतिरिक्त दृश्य और डाटा प्रोसेसिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) का उपयोग.

6. प्रतिनिधि परिणाम

जठरनिर्गम एक LVN से रिकॉर्डिंग के साथ साथ STG केकड़ा के केंद्रीय पैटर्न जनरेटर में, चित्रा 2 दो न्यूरॉन्स (पीडी, जठरनिर्गम फैलनेवाली पेशी न्यूरॉन एल.पी., पार्श्व जठरनिर्गम न्यूरॉन) के युगपत रिकॉर्डिंग से पता चलता है. एल.पी. और पी.डी. उनके intracellular रिकॉर्डिंग के आधार पर पहचान की न्यूरॉन्स के ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग से पता चलता है कि वास्तव में कोशिकी एल.पी. और पीडी न्यूरॉन्स इसी रिकॉर्डिंग के साथ इन अच्छी तरह से मैच. स्पाइक चोटियों के ऑप्टिकल और LVN रिकॉर्डिंग के बीच एक सुसंगत 12 एमएस देरी (चित्रा 2 की इनसेट देख) नाड़ीग्रन्थि और बाह्य रिकॉर्डिंग साइट के बीच axonal संचरण देरी की वजह से है. प्रस्तुत डाटा भी पता चलता है कि सोम दर्ज न्यूरॉन्स के spikes के लिए संगत में तंत्रिका गतिविधि स्पष्ट रूप से detectable है.

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चित्रा 1 ए) stomatogastric तंत्रिका तंत्र (STNS) के योजनाबद्ध आरेख. दांता, नाड़ीग्रन्थि commissural, ओग, esophageal नाड़ीग्रन्थि, STG, stomatogastric नाड़ीग्रन्थि, STN, stomatogastric तंत्रिका, LVN, पार्श्व निलय तंत्रिका. बी) केकड़े stomatogastric (STG) नाड़ीग्रन्थि - छवि STG न्यूरॉन्स की semicircular पीछे व्यवस्था से पता चलता है.

चित्रा 2
2 चित्रा एक पीडी के साथ - साथ एकल झाडू रिकॉर्डिंग और एक एल.पी. न्यूरॉन LVN की रिकॉर्डिंग के साथ मिलकर. आंकड़ों से पता चलता है कि कि ऑप्टिकल और तंत्रिका रिकॉर्डिंग बहुत अच्छी तरह से मैच और है कि हम तंत्रिका तंत्रिका फार्म दर्ज spikes को इसी गतिविधियों की पहचान कर सकते हैं. दोनों ऑप्टिकली और विद्युत दर्ज - और उनकी औसत ऑप्टिकली और विद्युत दर्ज की गतिविधियों के बीच मैच का प्रदर्शन इनसेट एल.पी. कार्रवाई क्षमता के कई sweeps के एक उपरिशायी से पता चलता है. कारण यह तथ्य है कि हमारे ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग विधि हम भी धीमी झिल्ली संभावित परिवर्तन पीडी और एल.पी. 14 न्यूरॉन्स के लिए विशेषता रिकॉर्ड करने में सक्षम हैं डेटा की कम आवृत्ति घटकों को फ़िल्टर नहीं करता है.

Discussion

पारंपरिक तरीकों इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (अंतर और बाह्य इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग) के साथ संयोजन में न्यूरॉन्स STG वोल्टेज संवेदनशील डाई 8,9 इमेजिंग कैसे इस छोटे, अच्छी तरह से जाना जाता है और अभी भी जटिल तंत्रिका प्रणाली काम करती है की एक बेहतर समझ की अनुमति देता है. STG केंद्रीय पैटर्न जनरेटर (CPG) neuronal नेटवर्क, 10, 11, इस प्रकार STG के आकस्मिक कार्यात्मक संपत्तियों की एक बेहतर समझ भी समझ कैसे सामान्य में मदद मिलेगी (यह जठरनिर्गम और गैस्ट्रिक चक्की लय नेटवर्क भी ​​शामिल है) के एक प्रोटोटाइप है CPG के नेटवर्क अपने नेटवर्क के स्तर कार्यक्षमता उत्पन्न करते हैं. CPG के नेटवर्क और उच्च संज्ञानात्मक 13 कार्यों में भी मोटर नियंत्रण 12 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, फलस्वरूप उनके आकस्मिक संपत्तियों की बेहतर समझ के तंत्रिका विज्ञान के कई क्षेत्रों में एक प्रमुख प्रभाव हो सकता है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम उल्म विश्वविद्यालय द्वारा, और SciMedia लिमिटेड (टोक्यो, जापान) द्वारा कम्प्यूटिंग और विज्ञान, कृषि और न्यूकैसल विश्वविद्यालय के इंजीनियरिंग के विज्ञान संकाय के स्कूल द्वारा समर्थन, स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MiCAM02 SciMedia Imaging system
BVAna v.10.08 SciMedia Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system
HL-151 Moritex, Tokyo, Japan Ultra-low ripple halogen light source
BX51 WI Olympus Corporation Upright microscope for epifluorescence imaging
20x imaging objective Olympus Corporation XLUMPLFL20XW/0.95 NA 0.95, WD 2.0mm
10x imaging objective Olympus Corporation UMPLFL10XW NA 0.30, WD 3.3mm
Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter Olympus Corporation MSWG2
Antivibration table Scientifica Ltd 63-534
PatchStar electrode manipulator Scientifica Ltd PS-7000C Micro-electrode manipulator
CED Power 1401 Cambridge Electronic Design Data acquisition board
DL708E Oscilloscope Yokogawa Intracellular amplifier
AC differential amplifier University of Kaiserslautern, Germany Extracellular amplifier
P-97 Flaming – Brown type electrode puller Sutter Instrument Co. Electrode puller
Sigma Microcentrifuge 1-14 Sigma-Aldrich Centrifuge
Genex Pipettors Mline Scientific Laboratory Supplies LTD PIP7774 PIP7774
Glass micropipette with filament Science Products GB100TF 8P Glass for micr–lectrodes
MicroFil – 34G World Precision Instruments, Inc. Microfil needle
Spike 2 v6.10 Cambridge Electronic Design Electrophysiology software
Di-8-ANEPPQ Cambridge BioScience BT61014 Fluorescent voltage sensitive dye
F-127 Pluronic Acid, DMSO Invitrogen P-3000MP Solvent
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Crab saline component
CaCl2 . 2H2O Sigma-Aldrich C3881 Crab saline component
KCl Sigma-Aldrich P3911 Crab saline component, electrolyte solution
MgCl2 . 6H2O Sigma-Aldrich M9272 Crab saline component
Trizma base Sigma-Aldrich T1503 Crab saline component
Maleic acid Sigma-Aldrich M0375 Crab saline component
Elastosil RT-601 Wacker, Munich, Germany Lining of Petri dishes

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References

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Stein, W., Städele, C., Andras, P. Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes. J. Vis. Exp. (49), e2567, doi:10.3791/2567 (2011).More

Stein, W., Städele, C., Andras, P. Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes. J. Vis. Exp. (49), e2567, doi:10.3791/2567 (2011).

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