漂白后荧光标记蛋白的荧光恢复（FRAP）在培养海马神经元的树突棘

Summary

FRAP已被用来量化绿色荧光蛋白（GFP）标记在培养细胞中的蛋白质的流动性。我们研究分析了GFP的荧光漂白后恢复的百分比移动/静止的分数。在这项研究中，FRAP刺海马神经元。

Abstract

FRAP已被用来量化GFP标记的蛋白质的流动性。使用一个强大的激励激光，一个GFP标记蛋白的荧光漂白，在感兴趣的区域。 GFP标记的来自该地区以外的的漂白蛋白扩散到感兴趣的区域时，该区域的荧光恢复。蛋白质的流动性进行了分析，通过测量荧光恢复率。这种技术可以用来描述蛋白质的流动性和周转率。

在这项研究中，我们对培养海马神经元（增强型绿色荧光蛋白）EGFP的载体。我们使用蔡司710共聚焦显微镜，光漂白的在一个单一的脊椎的绿色荧光蛋白的荧光信号，然后取时间的推移图像记录荧光漂白后恢复。最后，我们估计在刺的绿色荧光蛋白的移动和静止的分数的百分比，通过分析成像数据，使用ImageJ和Graphpad软件。

这FRAP协议显示了如何执行基本FRAP实验，以及如何对数据进行分析。

Protocol

1。神经元转

1. 文化胚胎第18天（E18）大鼠海马神经元- D -聚赖氨酸包MatTek 35毫米的玻璃底^菜 1 。 （DIV），在16-18天的体外转染的神经元，使用Clontech公司CalPhos哺乳动物转染试剂盒。首先，用1.5毫升培养基代替贝科改良Eagle培养基 （DMEM），每35毫米盘0.5小时之前转。 （步骤1.6）使用，保存在一个无菌的15毫升管的原培养液。
2. 混合使用无菌H _{2 O（Clontech}公司）和12.4μL2米钙的解决方案（Clontech公司）的总体积100μL的10μg的pEGFP - N1质粒DNA。
3. 从步骤1.2）中添加的混合物100μL2 ×哈佛商学院滴加而涡旋2 ×哈佛商学院在中等速度。
4. 让坐在混合物在室温下放置20分钟，然后添加步骤1.3）DMEM培养液培养的神经元最终混合物。
5. 为1-1.5小时，放入37℃培养箱中培养的神经元。
6. 删除磷酸钙介质中，然后用DMEM三次洗细胞。在返回培养皿中的孵化器，交流与原培养液DMEM培养基。

2。在脊柱的FRAP实验

1. 用于转染后二至四天的FRAP实验的神经元。
2. 从35毫米的玻璃底菜更换培养液，立即加入预热Tyrode液，其中包含（毫米），HEPES 10 5 145氯化钠，氯化钾，葡萄糖10，甘氨酸_0.005，2.6氯化钙和氯化镁₂ 1.3（用NaOH调整pH至7.4）。
3. 蔡司LSM 710共聚焦显微镜是用于FRAP实验。蔡司TempModule系统是用来控制温度（37℃），湿度和工作系统的CO _{2（5％）。}确保连接和一瓶水，这是用来平衡湿度，是装满了水，CO ₂坦克。
4. 查找100 ×目标（αplan的复消色差透镜100 × / 1.46油）的转染成熟树突。如果在盘转染细胞稀疏，寻找所需的细胞与40 ×的目标（计划NEOFLUAR 40 × / 1.3油），然后切换到100 ×目标捕捉图像。
5. 使用5 ×光学变焦和256 × 256像素分辨率的图像一小段几个刺的枝蔓。要拍摄图像，使用额定转速（像素停留时间为3.15微秒）需要0.5秒完成扫描。针孔设置为2μm的获得较强的荧光。到图像时，尝试使用激光传输低，例如1-5％，以避免漂白的整个形象。
6. 选择感兴趣的脊椎。在我们的实验中，我们选择与他们的脊柱头部直径约1微米的蘑菇刺。
7. 为了做一个FRAP实验，漂白前5个控制影像，然后漂白脊柱利益标称100％激光传输的10倍[氩激光功率为30兆瓦，488激光线的50％（15毫瓦），和约3-4毫瓦，达到通过显微镜488激光线]，然后漂白后，立即捕捉了一系列的图像。在这个实验中，图像被捕获漂白后每15秒1秒。调整的时间间隔应根据不同的目标蛋白质和不同的实验设计（ 图1） 。
8. 保存图像。

3。数据分析

1. 与ImageJ软件中打开图像。
2. 对齐使用对齐工具图像的堆栈 - ImageJ（“插件”→“栈洗牌”→“对齐堆栈片”→“翻译”和/或“刚体”），使脊柱的利益不浮换句话说 - 它仍然在同一位置上的图像。
3. 测量相对利益_（F S）的脊椎，一个转，但漂白地区（对照组），在时间的推移图像和背景区域_（F B）的荧光强度，使用ImageJ工具“力度V时间显示器”（ “插件“→”栈 - 洗牌“→”强度V时间显示器“）。控制区域可以是一个倍受关注的远端树突的一块。背景区是一个非荧光的地区。
4. 计算前（F _C0）和_（F C）漂白后，通过比较控制区的荧光光漂白率（R ）。
   R = _F C / F _C0。
5. 目标脊柱的荧光强度（F）的规范如下：
   F _=（F S - _F B）/ R。
6. 曲线拟合Graphpad Prism软件一阶段的指数方程（ 图2）或官方所用的荧光强度的目标脊柱ř类似软件。
7. 计算移动的分数_（F M）和不动的一小部分_（一 ）由下列公式：
   _F M = _F∞/ F _0，
   其中_，F∞全面复苏后的荧光强度_，F 0是前漂白的荧光强度。
   _F的第I = 1 - F _米。

4。代表性的成果：

在这项研究中，我们执行一个成熟的海马神经元的FRAP实验。在18-22格，已形成了蘑菇刺。用我们的方法，在一个小区域的荧光强度的动态变化，如脊椎，可以被记录下来。

要分析的EGFP荧光恢复过程中，我们采取控制之前，漂白和5张1图像的每1在15秒漂白后立即第二。图像分辨率是足够的定量分析。标记的荧光蛋白的荧光恢复型材高度重复性。

我们还简要说明如何定义一个荧光蛋白的移动和静止的分数，使用ImageJ和Graphpad Prism软件。我们在这里展示的FRAP方法和分析，可以广泛应用于神经科学，细胞生物学等研究。

图1。FRAP EGFP荧光测量在脊柱从培养的海马神经元。红色箭头指示的漂白时间。照片代表前同一地区（预），0，1，5，10，15秒​​后漂白。字母S，C和B，分别标有脊柱，控制和背景区域。在实验过程中，神经元保持在37 ° C。比例尺，1微米。

图2。FRAP EGFP荧光曲线超过15秒的时间。绿线显示了原始的曲线;红线显示正常化的曲线。曲线上的点显示FRAP每隔1秒。一个阶段的指数方程拟合曲线。漂白前的平均荧光计为100％。在这个实验中，移动的比例（MF）是94％，在不动的分数（IF）为6％。

Discussion

FRAP分析已被广泛使用在体内和体外^1-2研究。这种技术通常利用GFP 融合蛋白 ，虽然它也可以用红藻融合蛋白^3。这种分析是敏感的，可以用来描述GFP标记的蛋白质的流动性。

要产生有意义的FRAP分析，重要的是要避免不必要的漂白FRAP实验之前和期间。有两种方法来实现这一。首先，搜索和观察实验的神经元的过程要快。特别是，神经元与100X的目标很长一段时间的观察明显漂白的荧光。二，高的激光功率和频繁扫描，往往会增加漂白的可能性。因此，将需要计算在控制区域的漂白率，然后在实验地区的FRAP曲线正常化。正火的方法已被描述的协议（见步骤，细节为3.3-3.5）。

漂白步骤，也是确保获得良好FRAP结果的关键。在这个实验中，我们漂白利息的10倍，100％的激光传输的脊椎。这条件是足够的一个背景在一个固定的编制水平的脊柱荧光漂白的。因此，我们设置漂白后的荧光强度在0秒作为背景相同数量。根据在第一次扫描的速度，可能已经被检测到的荧光恢复大量感兴趣的蛋白质是流动性很强。

已经开发了许多荧光蛋白探针研究蛋白质动力学与FRAP。互补性办法，例如，使用photoactivatable GFP（PA - GFP的），或photoconvertible变种。连同FRAP还原技术，这些工具成为不可或缺的活细胞成像研究^4-6。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dishes	MatTek Corp.	P35GC-1.0-14-C
CalPhos Mammalian Transfection Kit	Clontech Laboratories	631312
pEGFP-N1 plasmid	Clontech Laboratories	6085-1
Zeiss confocal microscope	Carl Zeiss, Inc.	LSM 710
Zeiss TempModule system	Carl Zeiss, Inc.	N.A.
ImageJ software	National Institutes of Health	N.A.
Graphpad Prism software	GraphPad Software Inc.	N.A.