Summary
FRAP har använts för att kvantifiera rörlighet grön fluorescens protein (GFP)-märkta proteiner i odlade celler. Vi undersökte den mobila / orörliga fraktioner av GFP genom att analysera fluorescens återhämtning procent efter fotoblekning. I denna studie var FRAP utförs på ryggar av hippocampus neuroner.
Abstract
FRAP har använts för att kvantifiera rörlighet för GFP-märkta proteiner. Med hjälp av en stark excitation laser, fluorescens en GFP-märkta proteinet blekt i regionen av intresse. Fluorescensen i regionen återhämtar sig när oblekt GFP-märkta proteinet från utanför regionen diffunderar in i regionen av intresse. Rörligheten av proteinet analyseras sedan genom att mäta fluorescens återvinningsgrad. Denna teknik kan användas för att karaktärisera proteiner rörlighet och omsättningshastighet.
I denna studie uttrycker vi (Enhanced grönt fluorescerande protein) EGFP vektor i odlade hippocampus nervceller. Använda Zeiss 710 konfokalmikroskop, photobleach vi fluorescenssignalen av GFP protein i en enda ryggrad, och sedan ta bilder tid förflutit att spela in fluorescens återhämtning efter fotoblekning. Slutligen räknar vi andelen mobila och orörliga fraktioner av GFP i taggar, genom att analysera bilddata med hjälp av ImageJ och Graphpad mjukvaror.
Detta FRAP protokoll visar hur du utför en grundläggande FRAP experiment samt hur att analysera data.
Protocol
1. Neuron transfektion
- Kultur embryonala dag 18 (E18) råtta hippocampus neuroner på poly-D-lysin-belagda Mattek 35-mm glas-bottom rätter 1. Den 16-18 dagar in vitro (DIV), transfektera neuroner använder Clontech CalPhos Mammalian Transfektion Kit. Först ersätta odlingsmedium med 1,5 ml Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) per 35 mm maträtt 0,5 timme före transfektion. Spara den ursprungliga substratet i ett sterilt 15 ml rör för senare (steg 1,6) användas.
- Blanda 10 mikrogram pEGFP-N1 plasmid-DNA med steril H 2 O (Clontech) och 12,4 l 2 M kalcium (Clontech) till en total volym på 100 l.
- Tillsätt blandningen från steg 1,2) till 100 l 2 × HBS droppvis medan vortexa 2 × HBS på medelhög hastighet.
- Låt blandningen vila i rumstemperatur i 20 minuter och sedan lägga till den slutliga blandningen från steg 1,3) i DMEM ruvade nervceller.
- Sätt nervceller tillbaka i 37 ° C inkubator för 1-1,5 timmar.
- Ta bort kalciumfosfat-innehållande medium, tvätta sedan celler med DMEM tre gånger. Innan du returnerar den kultur skålen till inkubatorn, byta ut DMEM mediet med den ursprungliga odlingsmedium.
2. FRAP experiment på en ryggrad
- Nervceller används för FRAP experiment två till fyra dagar efter transfektion.
- Byt odlingsmedium från 35-mm glas-bottom maträtt, genom att omedelbart lägga förvärms Tyrode lösning, som innehåller (i mm) NaCl 145, KCl 5, HEPES 10, glukos 10, Glycine 0,005, CaCl 2 2,6 och MgCl 2 1.3 (pH justeras till 7,4 med NaOH).
- En Zeiss LSM 710 konfokalmikroskop används för FRAP experimentet. Zeiss TempModule system används för att reglera temperaturen (37 ° C), luftfuktighet och CO 2 (5%) av fungerande system. Se till att CO 2 tanken är ansluten och vattenflaskan, som används för att balansera luftfuktigheten, fylls med vatten.
- Hitta ett transfekterade mogen Dendrite med 100 × målet (αplan-APOCHROMAT 100 × / 1,46 olja). Om transfekterade celler i skålen är glesa, hitta en önskad cell med 40 × objektiv (plan-NEOFLUAR 40 × / 1,3 olja), och sedan byta till 100 × målet att ta bilder.
- Använd 5 × optisk zoom och en 256 × 256 pixlar för att bilden en kort bit Dendrite med flera taggar. För att fånga bilder, använda nominellt varvtal 9 (pixel uppehållstid 3,15 μsec) som tar 0,5 sekunder för att avsluta en scan. Den Pinhole är satt till 2μm att få en stark fluorescens. När du tar bilder, försök att använda låga laser överföring, till exempel 1-5%, för att undvika fotoblekning hela bilden.
- Välj ryggraden av intresse. I vårt experiment, väljer vi svamp ryggrader med sina diametrar ryggrad chef för ~ 1 mikrometer.
- För att göra en FRAP experimentera, ta 5 kontroll bilderna innan blekning, sedan bleka ryggrad av intresse 10 gånger till nominellt 100% Laser på [Argon laser makt är 30 mW, med 50% (15 mW) på 488 laserlinje och ca 3-4 mW når mikroskop genom 488 laserlinjen] och sedan ta en serie bilder omedelbart efter blekning. För det här experimentet är bilder tagna var 1 sekund i 15 sekunder efter blekning. Det tidsintervall bör justeras i enlighet med olika inriktning proteiner och olika experimentella modeller (Fig. 1).
- Spara bilder.
3. Dataanalys
- Öppna bilder med ImageJ programvara.
- Rikta bunten med bilder med hjälp av anpassa verktyget ("plugins" → "stackar - blanda" → "anpassa skivor staplade på varandra" → "översättning" och / eller "stel kropp) i ImageJ, så att ryggraden av intresse inte flyter , med andra ord - det förblir i samma position på bilden.
- Mät relativa fluorescensintensitet av ryggraden av intresse (F s), en transfekterade men oblekt region (kontroll), och en bakgrund region (F b) i bilder tid förflutit, med hjälp av "Intensity v Time Monitor 'verktyg för ImageJ (" plugins "→" stackar - blanda "→" Intensity mot Time Monitor). Kontrollen regionen skulle kunna vara en bit av väl fokuserad distala Dendrite. Bakgrunden regionen är en icke-fluorescerande regionen.
- Beräkna fotoblekning ränta (r) genom att jämföra fluorescens kontrollområdet före (F C0) och efter (F c) fotoblekning.
r = F C / F c0. - Normalisera fluorescensintensitet av målet ryggraden (F) enligt följande:
F = (F s - F b) / r. - Kurvpassning Fluorescensintensiteten av målet ryggraden med en en-fas exponentiell ekvation Graphpad Prism programvara (Fig. 2) eller Other liknande program.
- Beräkna den mobila fraktion (f m) och orörliga fraktion (f i) med följande ekvationer:
f m = F ∞ / F 0,
där F ∞ är fluorescensintensiteten efter full återhämtning, och F 0 är fluorescensintensiteten innan fotoblekning.
f i = 1 - f m.
4. Representativa resultat:
I denna studie gör vi en FRAP experiment på mogna hippocampus nervceller. Vid 18-22 DIV är svamp taggar redan bildats. Med vår metod kan de dynamiska förändringar av fluorescensintensiteten i en liten region, till exempel en ryggrad, spelas in.
För att analysera fluorescens återhämtningsprocessen av EGFP tar vi fem bilder som kontroller innan blekning och sedan en bild var 1 sekund omedelbart efter blekning i 15 sekunder. Upplösningen på bilden är tillräckligt för kvantitativ analys. Den fluorescens återhämtning profiler taggade fluorescens proteiner är mycket reproducerbar.
Vi har också kortfattat visa hur man definierar rörliga och orörliga delar av en fluorescens protein, med ImageJ och Graphpad Prism programvara. Den FRAP metod och analys visar vi här kan grovt användas i neurovetenskap, cellbiologi och andra studier.
Figur 1. FRAP mätningar av EGFP fluorescens i en ryggrad från en kultiverad hippocampus neuron. Den röda pilspetsar visar tiden för fotoblekning. Fotografier representerar samma område före (Pre) och vid 0, 1, 5, 10, 15 sekunder efter fotoblekning. Den delen av ryggraden, kontroll och bakgrund är märkta med bokstäverna S, C och B, respektive. Nervceller låg kvar på 37 ° C under experimentet. Skala bar, 1 mm.
Figur 2. FRAP kurvor EGFP fluorescens över en 15-sekunders period. Den gröna linjen visar den ursprungliga kurvan, den röda linjen visar den normaliserade kurvan. Punkterna på kurvorna visar FRAP var 1 sekund. Kurvorna var utrustad med en-fas exponentiella ekvationer. Den genomsnittliga fluorescens innan fotoblekning räknades som 100%. I detta experiment är den mobila fraktion (MF) 94% och orörliga fraktion (IF) är 6%.
Discussion
FRAP analys har i huvudsak använts i vivo och in vitro 1-2 studier. Denna teknik utnyttjar ofta GFP fusionsproteiner , även om det kunde också använda rödalgen fusionsproteiner 3. Denna analys är känslig och kan användas för att karaktärisera rörlighet för GFP-märkta proteiner.
Att skapa meningsfull FRAP analys är det viktigt att undvika onödiga fotoblekning före och under FRAP experimentet. Det finns två sätt att uppnå detta. Först bör processen att söka och följa den experimentella neuron vara snabb. Speciellt blekmedel observation av nervceller med ett 100X mål under en lång tid betydligt fluorescensen. För det andra, hög lasereffekt och täta scanning ökar ofta möjligheten till fotoblekning. Därför blir det nödvändigt att beräkna fotoblekning ränta i en kontroll region och sedan normalisera FRAP kurvan i den experimentella regionen. Den normalisering Metoden har beskrivits i protokollet (se steg 3,3-3,5 för detaljer).
Det fotoblekning steg är också avgörande för att säkerställa en god FRAP resultat. I detta experiment, blekmedel vi ryggraden av intresse 10 gånger på 100% laser överföring. Detta villkor är tillräckligt för att bleka fluorescens en ryggrad till bakgrundsnivån i ett fast beredning. Därför sätter vi fluorescensintensiteten till samma nummer som bakgrund på 0 sekunder efter fotoblekning. Beroende på hastigheten på första sökningen, kan en betydande del av fluorescens återhämtning redan kan upptäckas när proteinet av intresse är mycket rörliga.
Många fluorescerande proteinet prober har utvecklats för att studera proteiner dynamik med FRAP. Ett kompletterande tillvägagångssätt är till exempel att använda photoactivatable GFP (PA-GFP), eller photoconvertible varianter. Tillsammans med FRAP teknik, är dessa verktyg bli oumbärlig för live studier cell imaging 4-6.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute on Dövhet och andra sjukdomar kommunikation (NIDCD) Interna Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek Corp. | P35GC-1.0-14-C | |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech Laboratories | 631312 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech Laboratories | 6085-1 | |
| Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| Zeiss TempModule system | Carl Zeiss, Inc. | N.A. | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N.A. | |
| Graphpad Prism software | GraphPad Software Inc. | N.A. |
References
- Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines. J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).
- Grati, M. Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2. J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).
- Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion. PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).
- Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family. Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
- Sprague, B. L., McNally, J. G. FRAP analysis of binding: proper and fitting. Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).
