Summary
FRAP is gebruikt om de mobiliteit van de groene fluorescentie Protein (GFP)-gemerkte eiwitten in gekweekte cellen te kwantificeren. We hebben de mobiele / immobiele fracties van de GFP onderzocht door het analyseren van de fluorescentie herstel na fotobleken percentage. In deze studie werd uitgevoerd op FRAP stekels van hippocampale neuronen.
Abstract
FRAP is gebruikt om de mobiliteit van GFP-gemerkte eiwitten te kwantificeren. Met behulp van een sterke excitatie laser wordt de fluorescentie van een GFP-gelabelde eiwit gebleekt in de regio van belang. De fluorescentie van de regio zich herstelt wanneer de ongebleekte GFP-gelabelde eiwit van buiten de regio verspreidt in de regio van belang. De mobiliteit van het eiwit wordt vervolgens geanalyseerd door het meten van de fluorescentie recovery rate. Deze techniek kan worden gebruikt om eiwit-mobiliteit en omloopsnelheid te karakteriseren.
In deze studie, wij uitdrukking aan de (verbeterde green fluorescent protein) EGFP vector in gekweekte hippocampale neuronen. Met behulp van de Zeiss 710 confocale microscoop, we photobleach de fluorescentie-signaal van het GFP-eiwit in een wervelkolom, en neem dan een time lapse beelden naar de fluorescentie herstel na fotobleken te nemen. Tenslotte, schatten we het percentage van de mobiele en immobiele fracties van de GFP in stekels, door het analyseren van de gegevens met behulp van imaging ImageJ en GraphPad software.
Dit FRAP protocol laat zien hoe een basis FRAP experiment uit te voeren, alsook hoe de gegevens te analyseren.
Protocol
1. Neuron transfectie
- Cultuur embryonale dag 18 (E18) rat hippocampale neuronen op poly-d-lysine-gecoate MatTek 35-mm glazen bodem schalen 1. Op 16-18 dagen in vitro (DIV), transfecteren neuronen met behulp van de Clontech CalPhos zoogdieren Transfectie Kit. De eerste, vervang het kweekmedium met 1,5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) per 35 mm schaal 0,5 uur voorafgaand aan transfectie. Bewaar de originele kweekmedium in een steriele 15 ml buis voor later (stap 1.6) te gebruiken.
- Mix 10 microgram pEGFP-N1 plasmide DNA met een steriele H 2 O (Clontech) en 12,4 ul 2 M calcium-oplossing (Clontech) tot een totaal volume van 100 pi.
- Voeg het mengsel van stap 1.2) tot 100 ui 2 × HBS druppelsgewijs terwijl vortexen 2 × HBS met gemiddelde snelheid.
- Laat het mengsel bij kamertemperatuur zitten voor 20 minuten en voeg dan het uiteindelijke mengsel van stap 1.3) in DMEM-bebroede neuronen.
- Leg de neuronen in de 37 ° C incubator voor 1-1,5 uur.
- Verwijder de calcium-fosfaat-bevattende medium, daarna wassen cellen met DMEM drie keer. Voordat de cultuur schotel naar de couveuse, wisselen de DMEM medium met de oorspronkelijke cultuur medium.
2. FRAP experiment op een rug
- Neuronen zijn gebruikt voor de FRAP experiment twee tot vier dagen na transfectie.
- Vervang het kweekmedium van de 35-mm glas-onderste schaal, door onmiddellijk toe te voegen voorverwarmde Tyrode oplossing, die bevat (in mm) 145 NaCl, KCl 5, HEPES 10, Glucose 10, Glycine 0.005, CaCl 2 2.6, en MgCl 2 1.3 (pH ingesteld op 7,4 met NaOH).
- Een Zeiss LSM 710 confocale microscoop wordt gebruikt voor de FRAP experiment. De Zeiss TempModule systeem wordt gebruikt om de temperatuur (37 ° C), de luchtvochtigheid en de CO 2 (5%) van de werkende systeem te controleren. Zorg ervoor dat de CO 2-tank is aangesloten en de waterfles, die wordt gebruikt voor het balanceren van vocht, is gevuld met water.
- Zoek een volwassen getransfecteerd dendrieten met de 100 × objectief (αplan-APOCHROMAT 100 × / 1,46 olie). Als de getransfecteerde cellen in de schotel zijn schaars, zoeken naar een gewenste cel met de 40 × objectief (plan-NEOFLUAR 40 × / 1,3 olie), en dan overschakelen naar de 100 × doelstelling om beelden vast te leggen.
- Gebruik 5 × optische zoom en een 256 × 256 pixels resolutie van het imago van een kort stukje van de dendriet met diverse stekels. Voor het vastleggen van beelden, gebruik nominale snelheid 9 (pixelverblijftijd 3,15 μsec), die duurt 0,5 seconden tot het einde een scan. De pinhole is ingesteld om 2μm sterke fluorescentie te verkrijgen. Bij het maken van foto's, probeer dan een lage laser transmissie te gebruiken, bijvoorbeeld 1-5%, om te voorkomen dat fotobleken het hele beeld.
- Selecteer de ruggengraat van belang. In ons experiment hebben we gekozen paddestoel stekels met hun rug hoofd diameter van ~ 1 micrometer.
- Om dit te doen een FRAP experiment, neem 5 controle beelden voor het bleken, dan bleek de ruggengraat van de rente 10 keer tegen de nominale 100% laser transmissie [De argon laser vermogen is 30 mW, met 50% (15 MW) in de 488 laserlijn, en ongeveer 3-4 mW bereikt de microscoop door de 488 laserlijn], en vervolgens een reeks beelden vast te leggen direct na het bleken. Voor dit experiment worden de beelden vastgelegd elke 1 seconde voor 15 seconden na het bleken. Het interval van tijd moet worden aangepast op basis van verschillende targeting eiwitten en verschillende experimentele ontwerpen (afb. 1).
- Afbeeldingen opslaan.
3. Data-analyse
- Open beelden met ImageJ software.
- Plaats de stapel van beelden met behulp van de lijn gereedschap ('plugins' → 'stacks - shuffling' → 'lijn plakken in stack' → 'vertaling' en / of 'starre lichaam') in ImageJ, zodat de wervelkolom van belang niet zweven , met andere woorden - het blijft in dezelfde positie op de afbeelding.
- Meet de relatieve fluorescentie-intensiteit van de wervelkolom van belang (F s), een getransfecteerd maar ongebleekt regio (controle), en een achtergrond regio (F b) in time lapse beelden, met behulp van de 'Intensity v Time Monitor' instrument van ImageJ ("plugins '→' stacks - shuffling '→' Intensity v Time Monitor '). De controle regio kan een stuk van goed gerichte distale dendriet worden. De achtergrond regio is een niet-fluorescerende regio.
- Bereken de fotobleken tarief (r) door vergelijking van de fluorescentie van de controle-regio voor (F c0) en na (F c) fotobleken.
r = F c / F c0. - Normaliseren van de fluorescentie-intensiteit van de doelgroep wervelkolom (F) als volgt:
F = (F s - F b) / r. - Curve passen bij de fluorescentie-intensiteit van het doel wervelkolom met een een-fase exponentiële vergelijking van GraphPad Prism software (fig. 2) of Other soortgelijke software.
- Bereken de mobiele fractie (f m) en de immobiele fractie (f i) door de volgende vergelijkingen:
f m = F ∞ / F 0,
waar F ∞ is de fluorescentie-intensiteit na volledig herstel, en F 0 is de fluorescentie-intensiteit voor fotobleken.
f i = 1 - f m.
4. Representatieve resultaten:
In deze studie, voeren we een FRAP experiment op volwassen hippocampus neuronen. Op 18-22 DIV, zijn paddestoel stekels al gevormd. Met behulp van onze methode, kan de dynamische veranderingen van de fluorescentie-intensiteit in een kleine regio, zoals een ruggengraat, worden opgenomen.
Voor het analyseren van de fluorescentie herstelproces van EGFP, nemen we 5 foto's als controle voor het bleken en daarna een image elke 1 seconde direct na het bleken gedurende 15 seconden. De resolutie van het beeld is voldoende voor kwantitatieve analyse. De fluorescentie herstel profielen van de fluorescentie gelabelde eiwitten zijn zeer reproduceerbaar.
We hebben ook even laten zien hoe je de mobiele en immobiele fracties van een fluorescentie-eiwit, met behulp van ImageJ en GraphPad Prism software te definiëren. De FRAP methode en analyse tonen we hier kan grofweg worden gebruikt in de neurowetenschappen, de celbiologie en andere studies.
Figuur 1. FRAP metingen van EGFP fluorescentie in een rug van een beschaafde hippocampal neuron. De rode pijlen geven de tijd van fotobleken. Foto's vertegenwoordigen hetzelfde gebied voor (Pre) en op 0, 1, 5, 10, 15 seconden na fotobleken. De regio van de wervelkolom, controle-en achtergrond zijn gemarkeerd met letters S, C en B, respectievelijk. Neuronen werden gehandhaafd bij 37 ° C tijdens het experiment. Schaal bar, een urn.
Figuur 2. FRAP rondingen van EGFP fluorescentie over een 15-seconden periode. De groene lijn geeft de oorspronkelijke curve, de rode lijn geeft de genormaliseerde curve. De stippen in bochten tonen de FRAP elke 1 seconde. De curven werden gemonteerd door een fase exponentiële vergelijkingen. De gemiddelde fluorescentie voor fotobleken werd geteld als 100%. In dit experiment, de mobiele fractie (MF) is 94% en de immobiele fractie (IF) is 6%.
Discussion
FRAP analyse is algemeen gebruikt in vivo en in vitro studies 1-2. Deze techniek maakt gebruik van het algemeen GFP fusie-eiwitten , maar het kan ook gebruik maken van rode alg fusie-eiwitten 3. Deze analyse is gevoelig en kan gebruikt worden om de mobiliteit van de GFP-gemerkte eiwitten te karakteriseren.
Voor de productie van zinvolle FRAP analyse, is het belangrijk om onnodige fotobleken te vermijden voor en tijdens de FRAP experiment. Er zijn twee manieren om dit te bereiken. Ten eerste moet het proces om te zoeken en te observeren de experimentele neuron te snel. Vooral observatie van neuronen met een 100x objectief voor een lange tijd bleekmiddelen aanzienlijk fluorescentie. Ten tweede, een hoog laservermogen en frequent te scannen vergroten vaak de mogelijkheid van fotobleken. Zo zal het nodig zijn om de fotobleken tarief in een controlegebied vervolgens berekenen en de FRAP curve in de experimentele regio te normaliseren. Het normaliseren methode is beschreven in het protocol (zie stap 3,3-3,5 voor details).
De fotobleken stap is ook kritisch voor het waarborgen van goede FRAP resultaten. In dit experiment, we bleekwater de ruggengraat van de rente 10 keer op 100% laser transmissie. Deze voorwaarde is voldoende om het bleken van de fluorescentie van een ruggengraat naar achtergrondniveau in een vaste voorbereiding. Zo zetten we de fluorescentie-intensiteit op hetzelfde aantal als achtergrond op 0 seconden na fotobleken. Afhankelijk van de snelheid van de eerste scan, kan een aanzienlijke hoeveelheid fluorescentie herstel al worden gedetecteerd wanneer het eiwit van belang is zeer mobiel.
Veel fluorescerend eiwit probes zijn ontwikkeld voor het eiwit dynamica studie met FRAP. Een aanvullende benadering is, bijvoorbeeld, om te gebruiken fotoactiveerbare GFP (PA-GFP) of photoconvertible varianten. Samen met FRAP techniek worden deze tools steeds onmisbaar voor live cell imaging studies 4-6.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Institute on Doofheid en andere communicatie stoornissen (NIDCD, toont) Intramurale Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass-bottom dishes | MatTek Corp. | P35GC-1.0-14-C | |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech Laboratories | 631312 | |
| pEGFP-N1 plasmid | Clontech Laboratories | 6085-1 | |
| Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
| Zeiss TempModule system | Carl Zeiss, Inc. | N.A. | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | N.A. | |
| Graphpad Prism software | GraphPad Software Inc. | N.A. |
References
- Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines. J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).
- Grati, M. Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2. J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).
- Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion. PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).
- Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family. Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
- Sprague, B. L., McNally, J. G. FRAP analysis of binding: proper and fitting. Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).
