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Neuroscience

Photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति रिकवरी (FRAP) संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines में प्रतिदीप्ति प्रोटीन के टैग की गईं

doi: 10.3791/2568 Published: April 16, 2011

Summary

FRAP ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) टैग संवर्धित कोशिकाओं में प्रोटीन की गतिशीलता यों इस्तेमाल किया गया है. हम photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली प्रतिशत का विश्लेषण करके GFP के मोबाइल / स्थिर भिन्न जांच की. इस अध्ययन में, FRAP hippocampal न्यूरॉन्स के spines में प्रदर्शन किया गया था.

Abstract

FRAP GFP टैग प्रोटीन की गतिशीलता यों इस्तेमाल किया गया है. एक मजबूत उत्तेजना लेजर का प्रयोग, एक प्रोटीन GFP टैग के हित के क्षेत्र में प्रतिदीप्ति प्रक्षालित है. क्षेत्र के प्रतिदीप्ति ठीक है जब क्षेत्र के बाहर से सख़्त प्रोटीन GFP टैग हित के क्षेत्र में diffuses. प्रोटीन की गतिशीलता तो प्रतिदीप्ति वसूली दर को मापने के द्वारा विश्लेषण किया है. इस तकनीक के लिए प्रोटीन की गतिशीलता और कारोबार दर विशेषताएँ इस्तेमाल किया जा सकता है.

इस अध्ययन में, हम (बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) सुसंस्कृत hippocampal न्यूरॉन्स में EGFP वेक्टर व्यक्त करते हैं. Zeiss 710 confocal खुर्दबीन का उपयोग करना, हम एक एकल रीढ़ की हड्डी में GFP प्रोटीन के प्रतिदीप्ति संकेत photobleach, और फिर समय चूक चित्र लेने के लिए प्रतिदीप्ति वसूली के बाद photobleaching रिकॉर्ड. अंत में, हम इमेजिंग ImageJ और Graphpad सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करके कांटा में GFP के मोबाइल और स्थिर भिन्न के प्रतिशत का अनुमान है.

यह FRAP प्रोटोकॉल पता चलता है कि कैसे एक बुनियादी FRAP प्रयोग प्रदर्शन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कैसे डेटा का विश्लेषण करने के लिए.

Protocol

1. न्यूरॉन अभिकर्मक

  1. संस्कृति पाली - घ lysine-लेपित MatTek पर भ्रूण 18 दिन (E18) चूहे hippocampal न्यूरॉन्स 35 मिमी गिलास नीचे 1 व्यंजन. इन विट्रो में 16-18 दिनों में (DIV), transfect न्यूरॉन्स Clontech CalPhos स्तनधारी अभिकर्मक किट का उपयोग कर. सबसे पहले, 1.5 मिलीलीटर के साथ संस्कृति के माध्यम जगह Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 35 मिमी पकवान 0.5 घंटे प्रति अभिकर्मक के लिए पहले. बाद में उपयोग (1.6 कदम) के लिए एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में मूल संस्कृति के माध्यम सहेजें.
  2. बाँझ एच 2 (Clontech) हे और 12.4 μl 2 एम 100 μl की कुल मात्रा के लिए कैल्शियम समाधान (Clontech) के साथ 10 μg pEGFP N1 प्लाज्मिड डीएनए मिक्स .
  3. 1.2 कदम) से 100 2 μl मिश्रण जोड़ें × HBS dropwise vortexing जबकि 2 × HBS मध्यम गति से.
  4. चलो मिश्रण 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं और फिर 1.3 कदम) से DMEM - incubated न्यूरॉन्स अंतिम मिश्रण में जोड़ने.
  5. न्यूरॉन्स वापस 1-1.5 घंटे के लिए 37 ° सी इनक्यूबेटर में रखो.
  6. कैल्शियम फॉस्फेट युक्त मध्यम निकालें, तो DMEM तीन बार के साथ कोशिकाओं को धो लो. इनक्यूबेटर मुद्रा, संस्कृति डिश DMEM मध्यम मूल संस्कृति के माध्यम से लौटने से पहले.

2. एक रीढ़ पर FRAP प्रयोग

  1. न्यूरॉन्स अभिकर्मक के बाद दो से चार दिन FRAP प्रयोग के लिए उपयोग किया जाता है.
  2. 35 मिमी पकवान गिलास नीचे से तुरंत पूर्व गर्म Tyrode समाधान है, जो (मिमी में) NaCl 145, KCl 5, 10 HEPES 10 ग्लूकोज, 0.005 Glycine, 2.6 2 CaCl, और MgCl शामिल जोड़कर मध्यम संस्कृति, बदलें 1.3 2 (7.4 NaOH साथ समायोजित पीएच).
  3. एक Zeiss LSM 710 confocal खुर्दबीन FRAP प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया है. Zeiss TempModule प्रणाली (37 डिग्री सेल्सियस) तापमान, नमी और 2 में काम कर प्रणाली के सीओ (5%) पर नियंत्रण के लिए प्रयोग किया जाता है. यकीन है कि सीओ 2 टैंक जुड़ा हुआ है और पानी की बोतल, जो नमी संतुलन के लिए प्रयोग किया जाता है पानी से भरा है .
  4. 100 × उद्देश्य (100 αplan APOCHROMAT × 1.46 / तेल) के साथ एक ट्रांसफ़ेक्ट परिपक्व dendrite का पता लगाएं. यदि पकवान में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं विरल, 40 के साथ एक वांछित कक्ष के लिए खोज × उद्देश्य (योजना NEOFLUAR 40 × 1.3 / तेल), और फिर 100 से स्विच × छवियों पर कब्जा करने के उद्देश्य हैं.
  5. का प्रयोग करें 5 × ऑप्टिकल जूम और एक 256 × 256 पिक्सेल छवि के संकल्प कई कांटा के साथ एक dendrite से कम टुकड़ा. छवियों पर कब्जा करने के लिए, नाममात्र की गति 9 (पिक्सेल समय 3.15 μsec ध्यान केन्द्रित करना) जो 0.5 दूसरा स्कैन समाप्त करने के लिए लेता है का उपयोग करें. pinhole 2μm करने के लिए सेट कर दिया जाता है को मजबूत प्रतिदीप्ति प्राप्त है. जब लेने छवियों, कम लेजर संचरण का उपयोग करने की कोशिश, उदाहरण के लिए 1-5% के लिए, पूरी छवि photobleaching से बचने.
  6. ब्याज की रीढ़ की हड्डी का चयन करें. हमारे प्रयोग में, हम ~ 1 सुक्ष्ममापी की उनकी रीढ़ सिर diameters के साथ मशरूम कांटा का चयन करें.
  7. FRAP प्रयोग करने के लिए, विरंजन पहले 5 छवियों नियंत्रण ले, तो ब्लीच नाममात्र 100% लेजर संचरण में 10 बार ब्याज की रीढ़ [argon लेजर बिजली 30 मेगावाट है, 488 लेजर लाइन में 50% (15 मेगावाट) के साथ, और 488 लेजर लाइन] के माध्यम से लगभग 3-4 मेगावाट खुर्दबीन पहुँचता है, और तब विरंजन के तुरंत बाद छवियों की एक श्रृंखला पर कब्जा. इस प्रयोग के लिए, छवियों विरंजन के बाद 15 सेकंड के लिए हर 1 सेकंड कब्जा कर रहे हैं. समय के अंतराल पर विभिन्न लक्ष्यीकरण प्रोटीन और विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइन (1 छवि) के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए .
  8. छवियों को बचाने.

3. डेटा विश्लेषण

  1. ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ छवियों को खोलें.
  2. उपकरण संरेखित का उपयोग कर छवियों के ढेर संरेखित ImageJ में ('plugins के' → ढेर 'फेरबदल' → → 'अनुवाद' और / या 'कठोर शरीर' ढेर में स्लाइस संरेखित '), ताकि ब्याज की रीढ़ नाव नहीं है , दूसरे शब्दों में - यह छवि पर उसी स्थिति में रहता है.
  3. ब्याज की रीढ़ की हड्डी (एफ एस), एक ट्रांसफ़ेक्ट लेकिन कड़ा क्षेत्र (नियंत्रण), और समय चूक छवियों में एक पृष्ठभूमि क्षेत्र (ख एफ) के रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता उपाय, ImageJ की तीव्रता 'v समय मॉनिटर' ('plugins के उपकरण का उपयोग → ढेर 'फेरबदल' → 'तीव्रता v टाइम' मॉनिटर). नियंत्रण के क्षेत्र में अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित बाहर का dendrite का एक टुकड़ा किया जा सकता है. पृष्ठभूमि क्षेत्र में एक गैर फ्लोरोसेंट क्षेत्र है.
  4. (C0 एफ) से पहले और एफ (ग) photobleaching के बाद नियंत्रण क्षेत्र के प्रतिदीप्ति की तुलना द्वारा photobleaching दर (आर) की गणना.
    r = एफ / एफ c0.
  5. सामान्यकरें निम्नानुसार लक्ष्य रीढ़ की प्रतिदीप्ति तीव्रता (एफ):
    एफ = (एफ - एफ ख) आर /
  6. वक्र Graphpad चश्मे सॉफ्टवेयर के एक चरण घातीय समीकरण (छवि 2) या othe के साथ लक्ष्य रीढ़ की प्रतिदीप्ति तीव्रता फिटr इसी तरह के सॉफ्टवेयर.
  7. मोबाइल (च मीटर) अंश और निम्न समीकरण द्वारा स्थिर अंश (मैं च) गणना:
    छो = एफ / ∞ 0 एफ,
    जहां एफ पूरी वसूली के बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता है, और एफ 0 photobleaching पहले प्रतिदीप्ति तीव्रता है .
    च = 1 मैं - च मीटर

4. प्रतिनिधि परिणाम:

इस अध्ययन में, हम परिपक्व hippocampal न्यूरॉन्स पर एक FRAP प्रयोग करते हैं. 18-22 DIV, मशरूम कांटा पहले से ही बनते हैं. हमारी पद्धति का उपयोग करके, एक छोटे से क्षेत्र में प्रतिदीप्ति तीव्रता के गतिशील परिवर्तन, जैसे रीढ़, दर्ज किया जा सकता है.

EGFP के प्रतिदीप्ति वसूली की प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए, हम विरंजन से पहले नियंत्रण के रूप में 5 छवियों और फिर 1 हर 1 के तुरंत बाद 15 सेकंड के लिए विरंजन दूसरी छवि ले. छवि के संकल्प के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त है. टैग प्रतिदीप्ति प्रोटीन की प्रतिदीप्ति वसूली प्रोफाइल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं.

हम भी संक्षेप में बताएंगे कि कैसे एक प्रतिदीप्ति प्रोटीन का मोबाइल और स्थिर भिन्न ImageJ और Graphpad चश्मे सॉफ्टवेयर का उपयोग को परिभाषित करने के लिए. FRAP विधि और विश्लेषण हम यहाँ दिखाने के लिए मोटे तौर पर तंत्रिका विज्ञान, कोशिका जीव विज्ञान और अन्य अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. EGFP प्रतिदीप्ति के एक सुसंस्कृत hippocampal न्यूरॉन से एक रीढ़ की हड्डी में FRAP माप. लाल arrowheads photobleaching के समय संकेत मिलता है. फोटो से पहले एक ही क्षेत्र (पूर्व) का प्रतिनिधित्व करते हैं और 0 पर, 1, 5, 10, 15 सेकंड के बाद photobleaching. रीढ़ की हड्डी, नियंत्रण, और पृष्ठभूमि के क्षेत्र में एस सी, और बी, क्रमशः पत्र के साथ चिह्नित हैं. न्यूरॉन्स 37 ° C पर प्रयोग के दौरान बनाए रखा गया. स्केल बार, सुक्ष्ममापी 1.

चित्रा 2
चित्रा 2. FRAP घटता EGFP प्रतिदीप्ति के एक 15 सेकंड की अवधि से अधिक. हरी लाइन मूल वक्र से पता चलता है, लाल रेखा सामान्यीकृत वक्र दिखाता है. घटता पर डॉट्स FRAP हर 1 सेकंड दिखा. घटता एक चरण घातीय समीकरण द्वारा लगे थे. photobleaching पहले औसत प्रतिदीप्ति 100% के रूप में गिना गया था. इस प्रयोग में, मोबाइल अंश (एमएफ) 94% और स्थिर अंश (यदि) 6% है.

Discussion

FRAP विश्लेषण मोटे तौर पर दिया गया है और इन विट्रो 1-2 अध्ययन में vivo में प्रयोग किया जाता है. इस तकनीक सामान्यतः GFP इस्तेमाल संलयन प्रोटीन , हालांकि यह भी लाल alga की संलयन 3 प्रोटीन का इस्तेमाल कर सकते हैं . इस विश्लेषण के प्रति संवेदनशील है और GFP टैग प्रोटीन की गतिशीलता विशेषताएँ इस्तेमाल किया जा सकता है.

सार्थक FRAP विश्लेषण का उत्पादन करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है के पहले और FRAP प्रयोग के दौरान अनावश्यक photobleaching से बचने के लिए. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए वहाँ दो तरीके हैं. सबसे पहले, खोज और प्रयोगात्मक न्यूरॉन निरीक्षण की प्रक्रिया तेजी से होना चाहिए. विशेष रूप से, एक लंबे समय के लिए एक 100X उद्देश्य से न्यूरॉन्स का अवलोकन काफी प्रतिदीप्ति bleaches. दूसरा, उच्च लेजर शक्ति और लगातार स्कैनिंग अक्सर photobleaching की संभावना में वृद्धि. इस प्रकार, यह एक नियंत्रण क्षेत्र में photobleaching दर की गणना और फिर FRAP सामान्य वक्र क्षेत्र में प्रयोगात्मक आवश्यक हो जाएगा. सामान्य विधि प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया है (विवरण के लिए 3.3-3.5 कदम देखें).

photobleaching कदम भी अच्छा FRAP परिणाम सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रयोग में, हम 100% लेजर ट्रांसमिशन में 10 बार ब्याज की रीढ़ ब्लीच. इस हालत एक निश्चित तैयारी में पृष्ठभूमि स्तर के लिए एक रीढ़ की प्रतिदीप्ति ब्लीच करने के लिए पर्याप्त है. इस प्रकार, हम photobleaching के बाद 0 सेकंड में पृष्ठभूमि के रूप में एक ही नंबर के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता सेट. प्रथम स्कैन की गति पर निर्भर करता है, प्रतिदीप्ति वसूली का एक महत्वपूर्ण राशि पहले से ही पता चला जब ब्याज की प्रोटीन अत्यधिक मोबाइल हो सकता है.

कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन जांच FRAP के साथ प्रोटीन की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए एक पूरक दृष्टिकोण है, photoactivatable GFP (पीए GFP), या photoconvertible वेरिएंट का उपयोग. FRAP तकनीक के साथ साथ में, इन उपकरणों जीना सेल इमेजिंग अध्ययन 4-6 के लिए अपरिहार्य होते जा रहे हैं .

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम बहरापन और अन्य संचार विकार पर राष्ट्रीय संस्थान (NIDCD) अंदर प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dishes MatTek Corp. P35GC-1.0-14-C
CalPhos Mammalian Transfection Kit Clontech Laboratories 631312
pEGFP-N1 plasmid Clontech Laboratories 6085-1
Zeiss confocal microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 710
Zeiss TempModule system Carl Zeiss, Inc. N.A.
ImageJ software National Institutes of Health N.A.
Graphpad Prism software GraphPad Software Inc. N.A.

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References

  1. Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines. J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).
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Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (50), e2568, doi:10.3791/2568 (2011).More

Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (50), e2568, doi:10.3791/2568 (2011).

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