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Neuroscience

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

doi: 10.3791/2568 Published: April 16, 2011

Summary

FRAP는 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그 교양 세포에있는 단백질의 이동성을 계량하는 데 사용되었습니다. 우리는 photobleaching 후 형광 복구 비율을 분석하여 GFP의 모바일 / 고정되어 분수를 조사. 본 연구에서는, FRAP는 hippocampal 뉴런의 쪽이에서 수행되었다.

Abstract

FRAP는 GFP - 태그 단백질의 이동성을 계량하는 데 사용되었습니다. 강한 여기 레이저를 사용하여 GFP - 태그 단백질의 형광은 관심 지역에 표백됩니다. 지역의 외부에서 표백하지 않은 GFP - 태그 단백질 관심의 영역으로 diffuses 때 지역의 형광은 복구합니다. 단백질의 이동성은 다음 형광 복구 속도를 측정하여 분석합니다. 이 기술은 단백질 이동성과 회전율 속도를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.

본 연구에서는, 우리는 교양 hippocampal 뉴런의 (녹색 형광 단백질 강화) EGFP 벡터를 표현한다. 자이스 혈구 710 공촛점 현미경을 사용하여, 우리는 하나의 척추에 GFP 단백질의 형광 신호를 photobleach 다음 photobleaching 후 형광 회복을 기록 시간 경과 이미지를 가져가라. 마지막으로, 우리는 ImageJ와 Graphpad의 소프트웨어를 사용하여 영상 데이터를 분석하여, 쪽이에서 GFP의 모바일 및 고정되어 분수의 비율을 예상하고있다.

이 FRAP 프로토콜은뿐만 아니라 데이터를 분석하는 방법으로 기본 FRAP 실험을 수행하는 방법을 보여줍니다.

Protocol

1. 신경 세포의 transfection

  1. 폴리 - D - 라이신 - 코팅 MatTek에 문화 배아 일 18 일 (E18) 쥐 hippocampal 뉴런은 35 mm 유리 바닥 요리 1. 체외에서 16-18일에서 (DIV), Clontech CalPhos 포유 동물 Transfection 키트를 사용하여 transfect의 뉴런. 첫째, 1.5 ML있는 문화 매체를 교체 Dulbecco의 수정된 이글 중간 transfection하기 전에 35 - mm 요리 0.5 시간당 (DMEM). 나중에 (단계 1.6) 사용할 수있는 살균 15 ML 튜브에서 원래 문화 매체를 저장합니다.
  2. 무균 H 2 O (Clontech) 100 μl의 총 볼륨에 12.4 μl 2 M의 칼슘 용액 (Clontech) 10 μg pEGFP - N1 플라스미드 DNA를 섞습니다.
  3. 100 μl 2 단계 1.2)의 혼합물을 추가 × HBS dropwise vortexing이 동안 × 중간 속도 HBS.
  4. 혼합물은 20 분 실온에서 앉아 후 DMEM - incubated 뉴런에 1.3 단계)에서 최종 혼합물을 추가하자.
  5. 1-1.5 시간 동안 37 ° C 배양기로 다시 뉴런 놔.
  6. 인산 칼슘 함유 매체를 제거 후 DMEM 세 번와 세포를 씻으십시오. 원래 문화 매체와 DMEM 매체 인큐베이터, 교류 문화 요리를 반환하기 전에.

2. 척추에 FRAP 실험

  1. 뉴런은 2~4일 transfection 후 FRAP 실험에 사용됩니다.
  2. 즉시 (MM)를 NaCl 145, KCl 5, HEPES 10, 포도당 10, 글리신 0.005, CaCl 2 2.6, 및 MgCl가 포함되어 있습니다 미리 예열 Tyrode 솔루션을 추가하여, 35 mm 유리 바닥 요리에서 배지를 교체 1.3 (NaOH와 7.4로 조정 PH).
  3. 자이스 혈구 LSM 710 공촛점 현미경은 FRAP 실험에 사용됩니다. 자이스 혈구 TempModule 시스템은 온도 (37 ° C), 습도 및 작업 시스템의 CO 2 (5 %)을 제어하는 데 사용됩니다. CO 2 탱크가 연결되어 있고 습도를 균형에 사용되는 물 병은, 물로 채워져 있는지 확인합니다.
  4. 100 × 목표 (αplan - 고차 색지움 100 × / 1.46 오일)와 transfected 성숙 dendrite를 찾습니다. 접시에 transfected 세포가 스파스, 40 원하는 셀 검색 × 목표 (계획 - NEOFLUAR 40 × / 1.3 석유), 다음 100 × 스위치 이미지를 캡처하는 객관적인 경우.
  5. 5 × 광학 줌 사용 및 이미지 몇 쪽이과 dendrite의 짧은 조각을 위해 256 × 256 픽셀 해상도를. 이미지를 캡처하려면, 0.5 초이 검사를 완료하는 데 걸리는 속도 명목 9 (픽셀 시간이 3.15 μsec 살기)을 사용합니다. 핀홀은 강한 형광을 얻기 위해 2μm로 설정됩니다. 이미지를 복용하면, 전체 이미지를 photobleaching 피하기 위해, 예를 들어 1-5%에 대한 낮은 레이저 전송을 사용하려고합니다.
  6. 관심 척추를 선택합니다. 우리의 실험에서, 우리는 ~ 1 μm의 자신의 척추 헤드 지름과 버섯 쪽이을 선택합니다.
  7. FRAP 실험을 수행하려면 488 레이저 라인에서 50 % (15 MW)와 아르곤 레이저의 파워는 30 MW입니다 [표백 후, 표백하기 전에 정격 100 % 레이저 전송에 관심을 10 번의 척추를 5 컨트롤 이미지를 가지고, 약 3-4 MW는 488 레이저 라인]를 통해 현미경에 도달하고 즉시 표백 후 이미지의 시리즈를 캡처합니다. 본 실험의 경우, 이미지는 표백 후 15 초 동안 매 일초를 점령하고 있습니다. 시간 간격은 다른 타겟팅 단백질 및 다른 실험 설계 (그림 1)에 따라 조정되어야합니다.
  8. 이미지를 저장합니다.

3. 데이터 분석

  1. ImageJ 소프트웨어와 이미지를 엽니다.
  2. 관심 척추가 물에 뜨지 않는다 그래야, ImageJ에서 - (→ → '번역'및 / 또는 '엄격한 신체'스택에 조각 정렬 '플러그인'→ '걸어갔다 스택')은 정렬 도구를 사용하여 이미지의 스택 정렬 다른 단어 - 그것은 이미지에 동일한 위치에 남아 있습니다.
  3. ImageJ의 '강도 V 타임 모니터'도구 ( '플러그인을 사용하여 관심있는 척추 (F S), transfected지만, 표백하지 않은 영역 (제어), 그리고 시간 경과 이미지에서 배경 영역 (F B)의 상대 형광 강도를 측정 '→'스택 - 걸어갔다 '→'강도 V 타임 모니터 '). 제어 영역은 잘 집중 말초 dendrite의 조각 될 수 있습니다. 배경 지역이 아닌 형광등 지역입니다.
  4. 전에 (F C0)와 (F C) photobleaching 후 제어 영역의 형광을 비교하여 photobleaching 속도를 (R)을 계산.
    R = F C / F C0.
  5. 다음과 같이 대상 척추의 형광 강도 (F)를 정상화 :
    F = (F S - F B) / R.
  6. 커브가 한 단계 지수 Graphpad의 프리즘 소프트웨어의 방정식 (그림 2) 또는 인접해있는 대상 척추의 형광 강도에 맞게R 유사한 소프트웨어.
  7. 모바일 분율 (F M) 다음과 같은 등식으로 고정되어 분수를 (F I) 계산 :
    F M = F / F 0,
    어디 F 전체 복구 후 형광 강도이며, F 0 photobleaching 전에 형광 강도입니다.
    F I = 1 - F M.

4. 대표 결과 :

본 연구에서는, 우리는 성숙한 hippocampal 뉴런에 FRAP 실험을 수행합니다. 18-22 DIV에서 버섯 쪽이 이미 형성됩니다. 우리의 방법을 사용하여 같은 척추와 같은 작은 영역에서 형광 강도의 동적 변경, 녹음 수 있습니다.

EGFP의 형광 복구 프로세스를 분석하기 위해, 우리는 표백하기 전에 컨트롤로 5 이미지 다음 즉시 15 초 동안 표백 후 매 일초 한 이미지를 가져가라. 이미지의 해상도가 정량 분석​​을 위해 충분합니다. 태그 형광 단백질의 형광 복구 프로필이 높은 재현성 있습니다.

우리는 또한 간략하게 ImageJ 및 Graphpad의 프리즘 소프트웨어를 사용하여 형광 단백질의 모바일 및 고정되어 분수를 정의하는 방법을 보여줍니다. 우리가 여기에 표시 FRAP 방법 및 분석은 크게 신경 과학, 세포 생물학 연구와 다른 연구에서 사용할 수 있습니다.

그림 1
그림 1. 교양 hippocampal 신경 세포에서 척추에 EGFP 형광의 FRAP 측정. 빨간 화살촉은 photobleaching의 시간을 나타냅니다. 사진은 전에 동일한 영역을 (사전) 대표와 photobleaching 0, 1, 5, 10, 15 초 후. 척추, 제어 및 배경의 지역은 문자 각각 S, C와 B와 함께 표시됩니다. 뉴런은 실험 기간 동안 37 ° C에서 유지되었다. 스케일 바, 1 μm의.

그림 2
그림 2. 15 초 동안 EGFP 형광의 FRAP 곡선. 녹색 라인은 원래의 곡선을 보여주는, 빨간색 선은 표준 곡선을 보여줍니다. 곡선에있는 점들은 FRAP 매 일초을 보여줍니다. 곡선은 한 단계 지수 방정식으로 장착되었습니다. photobleaching 전에 평균 형광 100 %로 계산되었다. 본 실험에서는 모바일 분수 (MF)는 94%이고 고정되어 분수 (IF) 6 %입니다.

Discussion

FRAP 분석은 크게 생체내 및 시험 관내 1-2 연구에 사용되고 있습니다. 이 기술은 일반적으로 이용 GFP 융합 단백질을 그것도 빨간 알가의 융합 단백질 3을 사용할 수 있지만. 이 분석은 민감하고 GFP - 태그 단백질의 이동성을 특징하는 데 사용할 수 있습니다.

의미 FRAP 분석을 생산하기 위해서는 이전과 FRAP 실험 도중 불필요한 photobleaching을 방지하는 것이 중요합니다. 이것을 달성하기 위해 두 가지 방법이 있습니다. 첫째, 검색 및 실험 신경 세포를 관찰하는 과정이 빨리되어야합니다. 특히, 오랫동안 100X 목적으로 뉴런의 관찰 크게 형광 표백제로 닦았을. 둘째, 높은 레이저 전원과 상용 스캔은 종종 photobleaching의 가능성을 높일 수 있습니다. 그러므로, 그것은 통제 지역에서 photobleaching 율을 계산하고 실험 지역에서 FRAP 곡선을 정상화하기 위해 필요합니다. 정규화 방법 (자세한 내용은 단계 3.3-3.5 참조) 프로토콜에 설명되어있다.

photobleaching 단계는 또한 좋은 FRAP 결과를 확보 중요합니다. 본 실험에서는, 우리는 100 % 표백 레이저 전송에 관심이 10 배의 척추 있습니다. 이 조건은 표백 고정 준비 배경 수준으로 척추의 형광을하기에 충분합니다. 따라서, 우리는 photobleaching 후 0초에서 배경 같은 번호로 형광 강도를 설정합니다. 첫 번째 스캔의 속도에 따라 형광 복구의 상당량은 이미 관심의 단백질이 높은 휴대 때 감지 수 있습니다.

많은 형광 단백질 프로브는 FRAP과 단백질 역학을 연구하기 위해 개발되었습니다. 보완 접근 photoactivatable GFP (PA - GFP) 또는 photoconvertible 변종을 사용하는, 예를 들어 있습니다. 함께 FRAP 기술과 함께,이 도구는 라이브 셀 이미징 연구 4-6위한 필수가되고있다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 청각 및 기타 통신 장애에 국립 연구소 (NIDCD) 교내 프로그램에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass-bottom dishes MatTek Corp. P35GC-1.0-14-C
CalPhos Mammalian Transfection Kit Clontech Laboratories 631312
pEGFP-N1 plasmid Clontech Laboratories 6085-1
Zeiss confocal microscope Carl Zeiss, Inc. LSM 710
Zeiss TempModule system Carl Zeiss, Inc. N.A.
ImageJ software National Institutes of Health N.A.
Graphpad Prism software GraphPad Software Inc. N.A.

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References

  1. Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines. J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).
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  6. Sprague, B. L., McNally, J. G. FRAP analysis of binding: proper and fitting. Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).
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Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (50), e2568, doi:10.3791/2568 (2011).More

Zheng, C., Petralia, R. S., Wang, Y., Kachar, B. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (50), e2568, doi:10.3791/2568 (2011).

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