Summary
وقد أنشئت انطباق مقايسة لتقييم جدوى مولد الرمع الإنجابية لأكثر من 50 عاما. نحن هنا لشرح اجراءات عامة لأداء مولد الرمع مقايسة مع خلايا ملتصقة.
Abstract
تم تأسيس (أو تشكيل مستعمرة) مولد الرمع مقايسة لأكثر من 50 عاما ، وقد نشرت الورقة الأصلية التي تصف هذه التقنية في عام 1956 1. وبصرف النظر عن توثيق الأسلوب ، ولدت في دراسة المعالم الأولية أول منحنى الاستجابة للجرعة الاشعاع بالأشعة السينية المشع خلايا (هيلا) الثدييات في الثقافة 1. في الأساس ، وفحص مولد الرمع تمكن من إجراء تقييم للاختلافات في البقاء الإنجابية (قدرة الخلايا على إنتاج ذرية ، أي خلية واحدة لتشكيل مستعمرة من 50 أو أكثر من الخلايا) بين الخلايا والخلايا غير المعالجة السيطرة التي خضعت العلاجات المختلفة مثل التعرض والإشعاع المؤين ، والمركبات الكيميائية المختلفة (وكلاء السامة للخلايا ، مثلا) أو في الحالات الأخرى التلاعب الجيني. أصبح مقايسة التقنية الأكثر قبولا في البيولوجيا الإشعاعية واستخدمت على نطاق واسع لتقييم مدى حساسية الإشعاع من خطوط مختلفة من الخلايا. كذلك ، يستخدم عادة لفحص مولد الرمع لرصد فعالية مركبات تعديل والإشعاع لتحديد تأثيرات العوامل السامة للخلايا وغيرها من العلاجات المضادة للسرطان على قدرة تشكيل مستعمرة ، في خطوط مختلفة من الخلايا. وبقاء مولد الرمع نموذجية التجربة باستخدام الخلايا الملتصقة خطوط ينطوي على ثلاثة عناصر متميزة ، 1) معالجة المونولاير خلية في قوارير زراعة الأنسجة ، 2) إعداد تعليق خلية واحدة والطلاء عدد مناسب من الخلايا في أطباق بتري و 3) تحديد وتلطيخ المستعمرات بعد فترة حضانة ذات الصلة ، والتي يمكن أن تتراوح بين 1-3 أسابيع ، اعتمادا على خط الخلية. نحن هنا لشرح اجراءات عامة لأداء مولد الرمع مقايسة مع خطوط الخلايا الملتصقة مع استخدام لخلد الإنسان خط خلية خلية كيراتينية (FEP - 1811) 2. أيضا ، ويهدف لدينا هي لوصف الخصائص المشتركة للالمقايسات مولد الرمع بما في ذلك حساب الكفاءة والطلاء والكسور البقاء بعد التعرض للإشعاع من الخلايا ، ومثالا على التعديل استجابة للإشعاع مع استخدام صيغة الطبيعية المضادة للأكسدة.
Protocol
1. الثقافة الخلية وتعيين ما يصل التجريبي
- تمسك الكيراتينية monolayers الإنسان كما في 75 سم 2 القوارير زراعة الأنسجة التي تحتوي على 15 مل من SFM - خلية كيراتينية (K - SFM) المتوسط (GIBCO والمصل خالية متوسطة) تستكمل مع الجلوتامين L - (2 ملم) ، وعامل نمو البشرة (5 نانوغرام / مل) ، واستخراج الغدة النخامية البقري (40 ميكروغرام / مل) و 20 جنتاميسين ملغ / مل. تزرع الخلايا في بيئة ترطيب 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية.
- والخلايا في المصنف 12 × 25 سم 2 القوارير زراعة الأنسجة التي تحتوي على 5 مل من K - SFM المتوسط.
مستعدون تعليق خلية واحدة بواسطة trypsinization. تغسل الخلايا مع الفوسفات مخزنة المالحة وحضنت مع الحل التربسين / EDTA 0.05 ٪ لمدة 5-10 دقائق. عندما تبدأ الخلايا لتصبح مستديرة ومنفصلة ~ 30 ٪ ، يضاف 3 مجلدات متوسطة Dulbecco لتعديل النسر يحتوي على 10 ٪ مصل بقري جنيني لتحييد التربسين. يتم فصل الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا (20 مرات). يتم عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
والأرقام المصنفة الخلية المناسبة وفقا للوقت مضاعفة خط الخلية (حوالي 20 ساعة من أجل الإنسان الكيراتينية - 1811 FEP). الهدف هو تحقيق 90 ٪ confluency ~ (~ 10 6 خلايا في قارورة) في يوم من التجربة.
تجربة تتألف من 12 قوارير هو الأمثل لفحص مولد الرمع احد (ستة السيطرة غير المشع وستة قوارير المشع) والتي يمكن الانتهاء منه في أربع ساعات تقريبا.
2. والعلاج بالإشعاع
- علاج الخلايا لفترة مناسبة مع مجمع الإشعاع تعديل الخلايا ذات الصلة ، وفضح للإشعاع المؤين إما γ الإشعاع أو الأشعة السينية.
بين ستة قوارير بمثابة كفاءة الطلاء (غير المعالجة) والضوابط المخدرات فقط. والمشع الستة الأخرى القوارير.
في هذا المثال تعامل الإنسان مع التركيز الكيراتينية مختلف PF Cinnulin (CPF ؛ المغذيات النزاهة الدولية ، ربيع هيل ، تينيسي ، الولايات المتحدة ؛ بيانات تمثيلية للهو مبين 20 ميكروغرام / مل أدناه) ، وهو صياغة للذوبان في الماء الطبيعية المضادة للأكسدة ، لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. هي الخلايا المشع مع 4 غراي باستخدام مصدر سيزيوم 137 (1000 Gammacell irradiator النخبة ؛ Nordion الدولية ، ON ، كندا ؛ 1.6 غراي / دقيقة).
3. تصفيح
- بعد العلاج ، ويتم الحصول على تعليق خلية واحدة كما هو موضح سابقا.
- يتم حساب عدد الخلايا في كل عينة باستخدام بعناية عدادة الكريات والمخففة هي المصنفة بحيث أعداد الخلايا المناسبة في أطباق بتري (خمسة مكررات كل الأطباق في 15 ملم).
وينبغي توقع الطلاء الكفاءة و / أو كسر قيد الحياة عند البت في عدد من الخلايا على البذور في لوحة. الهدف هو تحقيق مجموعة من بين 20-150 المستعمرات.
يتم ترتيب أطباق بتري في مربع الاستنساخ البلاستيك ترطيب والمحتضنة في بيئة 5 ٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لتشكيل مستعمرة.
فترة حضانة لتشكيل مستعمرة يختلف من 1-3 أسابيع لخطوط مختلفة من الخلايا ، ومن المتفق عليه أن الوقت يجب أن يكون معادلا لانقسامات الخلية لا يقل عن ستة. في هذا المثال ، وأطباق لمراقبة الكيراتينية البشرية تتطلب ثمانية أيام لتشكيل استنساخ كبيرة بما فيه الكفاية التي تتكون من 50 أو أكثر من الخلايا.
4. تحديد ويلطخ المستعمرات
أكمل الخطوات التالية في غطاء الدخان.
- إزالة بلطف وسائل الإعلام من كل من الصفائح التي كتبها الطموح.
- يغسل كل لوحة المالحة مع 5 مل 0.9 ٪.
- إصلاح المستعمرات مع 5 مل من حل 10 ٪ محايدة الفورمالين مخزنة عن 15-30 دقيقة.
- وصمة عار مع 5 مل من الكريستال البنفسجي 0.01 ٪ (W / V) في DH 2 O ل 30-60 دقيقة.
- يغسل مع فائض البنفسجي الكريستال درهم 2 O والسماح الأطباق لتجف.
5. مستعمرة العد
Stereomicroscope
- يتم عد المستعمرات التي تحتوي على أكثر من 50 خلايا فردية باستخدام stereomicroscope.
التصوير الرقمي والتصوير العد باستخدام البرمجيات
- ويتم الحصول على الصور الرقمية من المستعمرات باستخدام الكاميرا أو جهاز المسح الضوئي
- يتم عد المستعمرات التصوير باستخدام حزم برمجيات التحليل على النحو المبين أدناه.
عد الخلايا باستخدام ImageJ (فيجي الإصدار 1.44a)
- فتح ملف الصورة في فيجي ، انتقل إلى ملف --> فتح.
- إذا اقتضى الأمر تحويل الصورة إلى تنسيق 8 بت ، انتقل إلى الصورة --> ضبط...-> عتبة.
- ضبط عتبة للحد من مستويات غير محددة الخلفية بحيث يتم الكشف عنها فقط في المستعمرات.
- عدد المستعمرات باستخدام ما يلي : اذهب إلى عملية --> ثنائي --> البحث عن ماكسيما.
صورة لهذا الشكل ، يمكن تعيين التسامح الضوضاء إلى 0. تأكد من أن الخيار تكتك الخلفية الخفيفة ومعاينة ماكسيما الكشف للتأكد من أن تم الانتهاء من جميع المستعمرات الخلية مسجلة بشكل صحيح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا المثال تم علاج الإنسان FEP - 1811 الكيراتينية بتركيزات مختلفة تصل الى 100 ميكروغرام / مل CPF ؛ تظهر البيانات لمدة 20 ميكروغرام / مل CPF لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. وكانت الخلايا المشع بعد العلاج مع 4 غراي باستخدام مصدر سيزيوم 137 (1000 Gammacell irradiator النخبة ؛ Nordion الدولية ، ON ، كندا ؛ 1.6 غراي / دقيقة). لمراقبة ومطلي العلاجات والأدوية المعالجة فقط 100 خلية في كل طبق بتري وكانت مطلية 1000 خلية لكل طبق لعينات المشع. كما هو مبين في الجدول أعلاه ، احصي المستعمرات باستخدام stereomicroscope أو الصور الرقمية (الشكل رقم 1) واتخذت لحساب باستخدام ImageJ. وقد استخدم عدد مستعمرة المتوسط للأطباق خمسة إلى حساب الكفاءة والطلاء وكسر قيد الحياة. وأشارت البيانات تأثير الاشعاع واقية (عامل الحماية ~ 3) في صياغة الطبيعية المضادة للأكسدة.
ممثل النتائج
| علاج | أسلوب العد | مطلي الخلية | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | الطلاء Efficiency1 | الباقين على قيد الحياة Fraction2 |
| علاج الخلايا | كتيب (stereomicroscope) | 100 | 19 | 22 | 38 | 14 | 20 | 0.23 | 1 |
| كتيب (الصورة الرقمية) | 100 | 22 | 23 | 34 | 15 | 22 | 0.23 | 1 | |
| العثور على ماكسيما (فيجي) | 100 | 23 | 21 | 33 | 14 | 21 | 0.22 | 1 | |
| 20 ملي CPF | كتيب (stereomicroscope) | 100 | 18 | 11 | 21 | 15 | 11 | 0.15 | 0.66 |
| كتيب (الصورة الرقمية) | 100 | 19 | 11 | 23 | 16 | 8 | 0.15 | 0.67 | |
| العثور على ماكسيما (فيجي) | 100 | 17 | 11 | 22 | 17 | 8 | 0.15 | 0.65 | |
| 4 غراي | كتيب (stereomicroscope) | 1000 | 39 | 27 | 28 | 44 | 28 | 0.03 | 0.14 |
| كتيب (الصورة الرقمية) | 1000 | 42 | 33 | 31 | 42 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| العثور على ماكسيما (فيجي) | 1000 | 42 | 35 | 30 | 43 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| 20 ملي CPF + 4 غراي | كتيب (stereomicroscope) | 1000 | 115 | 105 | 98 | 108 | 101 | 0.11 | 0.47 |
| كتيب (الصورة الرقمية) | 1000 | 117 | 102 | 104 | 103 | 99 | 0.11 | 0.45 | |
| العثور على ماكسيما (فيجي) | 1000 | 121 | 102 | 104 | 102 | 97 | 0.11 | 0.47 |
1 كفاءة التصفيحات عدها = عدد المستعمرات / عدد الخلايا مطلي
2 نسبة البقاء على قيد الحياة = (عدد من المستعمرات عدها / عدد الخلايا مطلي) / الكفاءة تصفيح
الجدول 1. حساب الكفاءة والطلاء والبقاء والمقارنة بين التهم مستعمرة باستخدام أساليب مختلفة
الشكل 1. عرض الصور الرقمية التي تنتجها المستعمرات البشرية ، FEP - 1811 ، الكيراتينية التالية الطلاء من 1000 حضانة الخلايا وثمانية أيام. (A) وخلايا المشع مع 4 غراي و (ب) تم علاج الخلايا التي تحتوي على 20 ميكروغرام / مل CPF لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية قبل التشعيع مع 4 غراي. تأثير الاشعاع واقية في صياغة الطبيعية المضادة للأكسدة هو واضح.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ومن المسلم به بدعم من المعهد الأسترالي للعلوم والهندسة النووية. وكان TCK المستلم من الجوائز AINSE. يتم اعتماد مختبر الطب التي Epigenomic الوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية في استراليا (566559). HR معتمد من قبل الاسترالي بعد التخرج والجوائز BakerIDI شرارة مشرق. ويتم تمويل هذا العمل من قبل لجنة حقوق الطفل للتنمية الطبية المحدودة التصوير (CRC - BID) ، التي أنشئت بموجب ودعمت الحكومة الأسترالية مراكز البحوث التعاونية البرنامج. ثاني أكسيد الكربون هو المستفيد استرالي بعد التخرج الجائزة وعلى منحة تكميلية CRC - BID.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon Instruments | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
