Summary
De toepasselijkheid van de Monogene assay voor het evalueren van reproductieve levensvatbaarheid is vastgesteld voor meer dan 50 jaar. Hier laten we zien de algemene procedure voor het uitvoeren van de Monogene assay met hechtende cellen.
Abstract
De Monogene (of kolonievormende) test is vastgesteld voor meer dan 50 jaar; de originele papieren beschrijving van de techniek werd gepubliceerd in 1956 1. Naast het documenteren van de methode, de eerste belangrijke studie opgewekte de eerste bestraling-dosis-respons curve voor X-ray bestraald zoogdieren (HeLa) cellen in cultuur 1. Kortom, de Monogene assay maakt een evaluatie van de verschillen in de reproductieve levensvatbaarheid (capaciteit van cellen om nageslacht te produceren, dwz een enkele cel tot een kolonie van 50 of meer cellen vorm) tussen controle onbehandelde cellen en cellen die hebben ondergaan verschillende behandelingen, zoals blootstelling aan aan ioniserende straling, diverse chemische verbindingen (bv. cytotoxische stoffen), of in andere gevallen genetische manipulatie. De test is uitgegroeid tot de meest geaccepteerde techniek in straling biologie en is op grote schaal gebruikt voor het evalueren van de straling gevoeligheid van verschillende cellijnen. Verder is de Monogene assay gebruikt voor het toezicht op de werkzaamheid van straling wijzigen verbindingen en voor het bepalen van de effecten van cytotoxische middelen en andere anti-kanker medicijnen op kolonievormende vermogen, in verschillende cellijnen. Een typische Monogene survival experiment met behulp van hechtende cellen lijnen bestaat uit drie afzonderlijke componenten, 1) de behandeling van de cel monolayer in weefselkweek flessen, 2) de voorbereiding van enkele cel suspensies en plating een passend aantal cellen in petrischalen en 3) de vaststelling en vlekken kolonies na een relevante incubatieperiode, kunnen die variëren van 1-3 weken, afhankelijk van de cellijn. Hier laten we zien de algemene procedure voor het uitvoeren van de Monogene test met aanhanger cellijnen met het gebruik van een onsterfelijke, menselijke keratinocyte cellijn (FEP-1811) 2. Ook onze doelstellingen zijn om de gemeenschappelijke kenmerken van Monogene proeven, waaronder de berekening van de beplating efficiency en de overleving fracties na blootstelling van cellen aan straling te beschrijven en modificatie van straling-response voorbeelden met het gebruik van een natuurlijke antioxidant formulering.
Protocol
1. Cultuur van de Cel en experimentele set-up
- Humane keratinocyten worden gehandhaafd als monolagen in 75 cm 2 weefselkweek kolven met 15 ml keratinocyte-SFM (K-SFM) medium (GIBCO, serum-vrij medium) aangevuld met L-glutamine (2 mM), epidermale groeifactor (5 ng / ml), runderen hypofyse-extract (40 ug / ml) en 20 mg / ml gentamicine. Cellen worden gekweekt in een bevochtigde 5% CO 2-omgeving bij 37 ° C.
- Cellen worden gezaaid in 12 x 25 cm 2 weefselkweek kolven met 5 ml van de K-SFM medium.
Eencellige suspensies worden bereid door behandeling met trypsine. Cellen worden gewassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing en geïncubeerd met een 0,05% trypsine / EDTA-oplossing voor 5-10 minuten. Wanneer de cellen beginnen te worden afgerond en ~ 30% zijn vrijstaand, is drie volumes van Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium dat 10% foetaal runderserum toegevoegd aan het trypsine te neutraliseren. De cellen worden losgemaakt door en neer te pipetteren (20 keer). Cellen worden geteld met behulp van een hemocytometer.
Juiste cel nummers zijn gezaaid op basis van de verdubbelingstijd van de cellijn (ongeveer 20 uur voor de menselijke FEP-1811 keratinocyten). Het doel is ~ 90% confluentie (~ 10 6 cellen per fles) te bereiken, op de dag van het experiment.
Een experiment dat bestaat uit 12 flessen is optimaal voor een enkele Monogene assay (zes bestraald controle en zes bestraald kolven) die kan worden voltooid in ongeveer vier uur.
2. Behandeling en Bestraling
- Behandel cellen voor een passende tijd met een relevante straling-modificerende verbinding en bloot cellen aan ioniserende straling of γ-straling of röntgenstraling.
Typisch zes flessen dienen als beplating efficiëntie (onbehandeld) en drugs alleen controles. De andere zes flessen worden bestraald.
In dit voorbeeld humane keratinocyten worden behandeld met verschillende concentraties van Cinnulin PF (CPF; Integriteit Nutraceuticals International, Spring Hill, TN, VS; representatieve gegevens voor 20 ug / ml is hieronder weergegeven), een water-oplosbare natuurlijke antioxidant formule, gedurende 1 uur bij 37 ° C. Cellen worden bestraald met 4 Gy met behulp van een 137 Cs bron (Gammacell 1000 Elite bestraler, Nordion International, ON, Canada; 1,6 Gy / min).
3. Plating
- Na de behandeling, zijn enkele celsuspensies verkregen zoals eerder beschreven.
- Het aantal cellen in elk monster worden geteld zorgvuldig met behulp van een hemocytometer en verwaterde zodanig dat juiste cel nummers zijn geënt in petrischalen (vijf herhalingen van elke in 15 mm gerechten).
De beplating efficiëntie en / of overblijvende fractie moet rekening worden gehouden bij het bepalen van het aantal cellen om zaad per plaat. Het doel is te komen tot een bereik van tussen 20 - 150 kolonies.
Petrischaaltjes zijn gerangschikt in een vochtige plastic klonen box en geïncubeerd in een 5% CO 2-omgeving bij 37 ° C voor de kolonie de vorming.
De incubatietijd voor de kolonie de vorming varieert van 1-3 weken voor verschillende cellijnen, het is aanvaard dat de tijd moet gelijkwaardig zijn aan ten minste zes celdelingen. In dit voorbeeld is de controle gerechten voor humane keratinocyten nodig acht dagen tot voldoende grote klonen bestaande uit 50 of meer cellen vormen.
4. Bevestigings-en kleuring Koloniën
Voer de volgende stappen in een zuurkast.
- Verwijder de media uit elk van de platen door aspiratie.
- Was elk bord met 5 ml 0.9% zoutoplossing.
- Bevestig de kolonies met 5 ml 10% neutraal gebufferde formaline oplossing voor 15-30 minuten.
- Vlek met 5 ml 0,01% (w / v) kristalviolet in dH 2 O voor 30-60 minuten.
- Was de overtollige kristalviolet met dH 2 O en laat gerechten drogen.
5. Kolonie tellen
Stereomicroscoop
- Kolonies met meer dan 50 individuele cellen worden geteld met behulp van een stereomicroscoop.
Digitale beeldvorming en het tellen met behulp van imaging-software
- Digitale beelden van de kolonies worden verkregen met behulp van een camera of scanner
- Kolonies worden geteld met behulp van imaging-analyse software pakketten zoals hieronder beschreven.
Cel tellen met behulp van ImageJ (Fiji versie 1.44a)
- Open het afbeeldingsbestand in Fiji, ga naar File -> Open.
- Indien nodig zet de afbeelding om 8-bits-formaat, ga naar Afbeelding -> Aanpassingen ...-> Drempel.
- Pas de drempel tot het niveau van de niet-specifieke achtergrond te verminderen, zodat alleen de kolonies worden gedetecteerd.
- Tellen kolonies met behulp van de volgende: ga naar Process -> Binary -> Zoek maxima.
Voor dit beeldformaat, kan geluid tolerantie op 0 gezet worden. Zorg ervoor dat de lichte achtergrond optie is aangevinkt eneen voorbeeld van de gedetecteerde maxima om te controleren of alle celkolonies correct zijn geregistreerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit voorbeeld is de menselijke FEP-1811 keratinocyten werden behandeld met verschillende concentraties tot 100 ug / ml CPF; gegevens worden getoond voor de 20 ug / ml CPF gedurende 1 uur bij 37 ° C. Na de behandeling cellen werden bestraald met 4 Gy met behulp van een 137 Cs bron (Gammacell 1000 Elite bestraler, Nordion International, ON, Canada; 1,6 Gy / min). Voor de controle onbehandelde en drugs alleen behandelingen 100 cellen werden uitgeplaat in elke petrischaal en 1000 cellen per schaal werden uitgeplaat voor de bestraalde monsters. Zoals aangegeven in de bovenstaande tabel, waren kolonies werden geteld met behulp van een stereomicroscoop of digitale beelden (afb. 1) genomen voor het tellen met behulp van ImageJ. De gemiddelde kiemgetal van de vijf schalen werd gebruikt om de efficiëntie en plating overleven fractie te berekenen. De gegevens die een beschermend effect straling (beschermingsfactor ~ 3) met de natuurlijke antioxidant formulering.
Representatieve resultaten
| Behandeling | Telmethode | Cel vergulde | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Plating Efficiency1 | Overleven Fraction2 |
| Onbehandelde cellen | Handmatig (Stereomicroscoop) | 100 | 19 | 22 | 38 | 14 | 20 | 0.23 | 1 |
| Handmatig (Digitaal beeld) | 100 | 22 | 23 | 34 | 15 | 22 | 0.23 | 1 | |
| Zoek Maxima (Fiji) | 100 | 23 | 21 | 33 | 14 | 21 | 0.22 | 1 | |
| 20 mM CPF | Handmatig (Stereomicroscoop) | 100 | 18 | 11 | 21 | 15 | 11 | 0.15 | 0.66 |
| Handmatig (Digitaal beeld) | 100 | 19 | 11 | 23 | 16 | 8 | 0.15 | 0.67 | |
| Zoek Maxima (Fiji) | 100 | 17 | 11 | 22 | 17 | 8 | 0.15 | 0.65 | |
| 4 Gy | Handmatig (Stereomicroscoop) | 1000 | 39 | 27 | 28 | 44 | 28 | 0.03 | 0.14 |
| Handmatig (Digitaal beeld) | 1000 | 42 | 33 | 31 | 42 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| Zoek Maxima (Fiji) | 1000 | 42 | 35 | 30 | 43 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| 20 mM CPF + 4 Gy | Handmatig (Stereomicroscoop) | 1000 | 115 | 105 | 98 | 108 | 101 | 0.11 | 0.47 |
| Handmatig (Digitaal beeld) | 1000 | 117 | 102 | 104 | 103 | 99 | 0.11 | 0.45 | |
| Zoek Maxima (Fiji) | 1000 | 121 | 102 | 104 | 102 | 97 | 0.11 | 0.47 |
1 Plating efficiency = aantal kolonies geteld / aantal cellen uitgeplaat
2 Surviving fractie = (aantal kolonies geteld / aantal cellen geplateerd) / plating efficiëntie
Tabel 1. Berekening van de plating efficiëntie en overleving en vergelijking van de kolonie telt met behulp van verschillende methoden
Figuur 1. Digitale afbeelding met kolonies geproduceerd door de mens, FEP-1811, keratinocyten na plating van 1000 cellen en acht dagen incubatie. (A) Cellen werden bestraald met 4 Gy en (B) cellen werden behandeld met 20 ng / mL CPF gedurende 1 uur bij 37 ° C voorafgaand aan de bestraling met 4 Gy. A-straling beschermend effect met de natuurlijke antioxidant formulering is evident.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De steun van het Australian Institute of Nuclear Science and Engineering wordt erkend. TCK was de ontvanger van AINSE awards. Epigenomisch Medicine Lab wordt ondersteund door de National Health en Medical Research Council van Australië (566.559). HR wordt ondersteund door een Australische post-graduate en BakerIDI Bright Spark awards. Dit werk wordt gefinancierd door het CRC for Biomedical Imaging Development Ltd (CRC-BID), opgericht en ondersteund door Cooperative de Australische regering Research Centres programma. CO is de ontvanger een Australische post-graduate award en een CRC-BID aanvullende beurs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon Instruments | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
