Summary
प्रजनन व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए clonogenic परख की प्रयोज्यता 50 से अधिक वर्षों के लिए स्थापित किया गया है. यहाँ हम पक्षपाती कोशिकाओं के साथ clonogenic परख के प्रदर्शन के लिए सामान्य प्रक्रिया का प्रदर्शन.
Abstract
clonogenic परख (या कॉलोनी बनाने) 50 से अधिक वर्षों के के लिए स्थापित किया गया है, मूल तकनीक का वर्णन कागज 1 1956 में प्रकाशित किया गया था. विधि दस्तावेजीकरण के अलावा, प्रारंभिक ऐतिहासिक अध्ययन एक्स - रे विकिरणित 1 संस्कृति में स्तनधारी (HeLa) कोशिकाओं के लिए पहली विकिरण खुराक प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न . नियंत्रण अनुपचारित कोशिकाओं और कोशिकाओं है कि जोखिम के रूप में विभिन्न उपचार आया है के बीच, असल में, clonogenic परख (50 या अधिक कक्षों की एक बस्ती के रूप में एक एकल कोशिका यानी कोशिकाओं की क्षमता को संतान का उत्पादन) प्रजनन व्यवहार्यता में मतभेद के एक आकलन के लिए सक्षम बनाता है विकिरण, विभिन्न रासायनिक यौगिकों (जैसे साइटोटोक्सिक एजेंट) या अन्य मामलों में आनुवंशिक हेरफेर. परख विकिरण जीव विज्ञान में सबसे व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते तकनीक बन गया है और व्यापक रूप से विभिन्न सेल लाइनों के विकिरण संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसके अलावा, clonogenic परख आमतौर पर विकिरण संशोधित यौगिकों की प्रभावकारिता की निगरानी के लिए और कॉलोनी विभिन्न सेल लाइनों में बनाने की क्षमता है, पर साइटोटोक्सिक एजेंटों और अन्य विरोधी कैंसर चिकित्सा के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक ठेठ clonogenic अस्तित्व पक्षपाती कोशिकाओं लाइनों का उपयोग कर प्रयोग में तीन अलग - अलग 1) सेल monolayer के टिशू कल्चर बोतल में उपचार, 2 घटक) एकल कक्ष निलंबन की तैयारी और पेट्री डिश और 3 में कोशिकाओं का एक उचित संख्या चढ़ाना) शामिल कालोनियों फिक्सिंग और धुंधला हो जाना एक प्रासंगिक ऊष्मायन अवधि के बाद, जो 1-3 सप्ताह से सेल लाइन पर निर्भर करता है, रेंज सकता है. यहाँ हम एक अमर मानव keratinocyte सेल लाइन का उपयोग (FEP-1811) 2 के साथ पक्षपाती सेल लाइनों के साथ clonogenic परख प्रदर्शन के लिए सामान्य प्रक्रिया का प्रदर्शन. इसके अलावा, हमारे उद्देश्य के लिए चढ़ाना और विकिरण के कक्षों के प्रदर्शन के बाद दक्षता भिन्न अस्तित्व की गणना सहित clonogenic assays के आम सुविधाओं का वर्णन है, और एक प्राकृतिक एंटीऑक्सीडेंट के निर्माण के उपयोग के साथ विकिरण प्रतिक्रिया के संशोधन का उदाहरण देना हैं.
Protocol
1. सेल संस्कृति और प्रायोगिक सेट अप
- मानव keratinocytes 75 सेमी 2 टिशू कल्चर keratinocyte - SFM के 15 एमएल (कश्मीर SFM) युक्त बोतल में monolayers के रूप में रखा जाता है मध्यम (GIBCO, सीरम मुक्त मध्यम) (2 मिमी) एल glutamine, epidermal वृद्धि कारक (5 एनजी के साथ पूरक /) एमएल, गोजातीय पीयूषिका (40 μg / एमएल) निकालने और 20 मिलीग्राम / एमएल gentamicin. कक्ष एक humidified 5% सीओ 2 पर्यावरण में 37 बड़े हो रहे हैं डिग्री सेल्सियस
- कक्ष 12 x 25 सेमी 2 टिशू कल्चर कश्मीर SFM मध्यम के 5 एमएल युक्त बोतल में वरीयता प्राप्त हैं .
एकल कक्ष निलंबन trypsinization द्वारा तैयार कर रहे हैं. प्रकोष्ठों के साथ फॉस्फेट खारा buffered धो रहे हैं और 5-10 मिनट के लिए एक 0.05% समाधान / trypsin EDTA साथ incubated. जब कोशिकाओं को बनने के लिए शुरू गोल और ~ 30% अलग कर रहे हैं, 3 Dulbecco संशोधित ईगल 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त मध्यम मात्रा trypsin बेअसर करने के लिए जोड़ा जाता है. कोशिकाओं ऊपर और नीचे pipetting (20 बार) द्वारा अलग कर रहे हैं. कक्ष एक hemocytometer का उपयोग गिने जाते हैं.
उपयुक्त कक्ष संख्या सेल लाइन (मानव FEP 1811 - keratinocytes के लिए लगभग 20 घंटे) की दुगनी समय के अनुसार वरीयता प्राप्त हैं. उद्देश्य के लिए प्रयोग के दिन पर ~ 90% confluency (~ 10 प्रति फ्लास्क 6 कोशिकाओं) प्राप्त है.
12 बोतल से मिलकर प्रयोग एक एकल clonogenic (छह unirradiated नियंत्रण और छह विकिरणित बोतल) परख है जो लगभग चार घंटे में पूरा किया जा सकता है है के लिए इष्टतम है.
2. उपचार और किरणन
- एक प्रासंगिक विकिरण संशोधित परिसर के साथ एक उपयुक्त समय के लिए कोशिकाओं का इलाज और विकिरण या तो γ विकिरण या एक्स - रे करने के लिए कोशिकाओं को बेनकाब.
आमतौर पर छह बोतल चढ़ाना (इलाज) दक्षता और नशीली दवाओं के ही नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं. अन्य छह बोतल विकिरणित हैं.
, 1 घंटे के लिए, एक पानी में घुलनशील प्राकृतिक एंटीऑक्सीडेंट तैयार इस उदाहरण में मानव keratinocytes Cinnulin पीएफ के विभिन्न एकाग्रता (; वफ़ादारी Nutraceuticals इंटरनेशनल, स्प्रिंग हिल, तमिलनाडु, अमेरिका 20 μg / एमएल नीचे दिखाया गया है के लिए प्रतिनिधि डेटा सीपीएफ) के साथ व्यवहार कर रहे हैं 37 में डिग्री सेल्सियस कक्ष 4 137 Cs स्रोत (, Nordion इंटरनेशनल, पर, कनाडा, 1.6 Gy / मिनट Gammacell 1000 अभिजात वर्ग irradiator) का उपयोग Gy के साथ विकिरणित हैं.
3. चढ़ाना
- उपचार के बाद, एकल कक्ष निलंबन के रूप में पहले वर्णित प्राप्त कर रहे हैं.
- प्रत्येक नमूने में ध्यान से एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या में गिना जाता है और पतला ऐसी है कि उचित सेल नंबर पेट्री डिश में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं (15 मिमी बर्तन में पांच प्रत्येक के replicates).
चढ़ाना दक्षता और / या अंश जीवित जब प्लेट प्रति बीज कोशिकाओं की संख्या तय करने के लिए प्रत्याशित होना चाहिए. 150 कालोनियों - उद्देश्य के लिए 20 के बीच की एक श्रेणी प्राप्त है.
पेट्री डिश एक humidified प्लास्टिक क्लोनिंग बॉक्स में व्यवस्थित होते हैं और 37 में एक 5% सीओ 2 पर्यावरण में incubated ° सी कॉलोनी गठन के लिए.
कॉलोनी गठन के लिए ऊष्मायन समय विभिन्न सेल लाइनों के लिए 1-3 सप्ताह से भिन्न होता है, यह स्वीकार किया है कि समय कम से कम छह कोशिका विभाजन के बराबर होना चाहिए. इस उदाहरण में, मानव keratinocytes नियंत्रण के लिए व्यंजन आठ दिनों के लिए 50 या अधिक कक्षों की पर्याप्त बड़ी मिलकर क्लोन के रूप में करने के लिए आवश्यकता होती है.
4. कालोनियों फिक्सिंग और धुंधला
एक धूआं हुड में निम्न चरणों को पूरा करें.
- धीरे प्लेटों के प्रत्येक से आकांक्षा से मीडिया को हटा दें.
- 5 एमएल 0.9% खारा के साथ एक थाली धो लें.
- 5 एमएल 10% तटस्थ 15-30 मिनट के लिए बफर formalin समाधान के साथ कालोनियों को ठीक करें.
- 5 एमएल 0.01% (w / v) DH 2 हे में 30-60 मिनट के लिए क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग .
- DH 2 हे के साथ अतिरिक्त क्रिस्टल बैंगनी धो और व्यंजन शुष्क करने की अनुमति .
5. कालोनी गिनती
Stereomicroscope
- 50 से अधिक व्यक्ति की कोशिकाओं से युक्त कालोनियों stereomicroscope का उपयोग करने के लिए गिने जाते हैं.
डिजिटल इमेजिंग और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गिनती
- कालोनियों के डिजिटल छवियों को प्राप्त कर रहे हैं एक कैमरे का उपयोग कर या स्कैनिंग डिवाइस
- कालोनियों इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर संकुल के रूप में नीचे वर्णित का उपयोग गिने जाते हैं.
सेल गिनती का उपयोग कर ImageJ (फिजी संस्करण 1.44a)
- फिजी में छवि फ़ाइल खोलें, फ़ाइल के लिए जाना -> खोलो.
- समायोजित> ...-> थ्रेसहोल्ड - यदि आवश्यक हो 8 बिट प्रारूप करने के लिए छवि परिवर्तित करने के लिए, छवि के लिए जाना.
- दहलीज समायोजित गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि के स्तर को कम इतना है कि केवल कालोनियों पता चला रहे हैं.
- निम्नलिखित का उपयोग कर कालोनियों गणना: प्रक्रिया के लिए जाने -> द्विचर -> मॅक्सिमा खोजें.
इस छवि प्रारूप के लिए, शोर सहिष्णुता 0 करने के लिए सेट किया जा सकता है. सुनिश्चित करें कि प्रकाश पृष्ठभूमि विकल्प ticked है औरपता चला मॅक्सिमा पूर्वावलोकन की जाँच करने के लिए कि सभी सेल कालोनियों को सही ढंग से पंजीकृत किया गया है.
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Discussion
इस उदाहरण में विभिन्न सांद्रता के साथ मानव FEP 1811 - keratinocytes इलाज किया गया 100 μg / एमएल सीपीएफ़, डेटा 1 घंटे के लिए 20 μg / एमएल सीपीएफ़ 37 डिग्री सेल्सियस के लिए दिखाया गया है बाद उपचार कोशिकाओं 4 137 Cs स्रोत (, Nordion इंटरनेशनल, पर, कनाडा, 1.6 Gy / मिनट Gammacell 1000 अभिजात वर्ग irradiator) का उपयोग Gy के साथ विकिरणित किया गया. नियंत्रण के लिए इलाज और दवा केवल 100 कोशिकाओं उपचार प्रत्येक पेट्री डिश में चढ़ाया गया और पकवान प्रति 1000 कोशिकाओं विकिरणित नमूने के लिए मढ़वाया गया. उपरोक्त तालिका में संकेत दिया, कालोनियों stereomicroscope या डिजिटल छवियों (चित्र 1) का उपयोग कर गिना रहे थे ImageJ का उपयोग कर की गणना के लिए ले जाया गया. पांच व्यंजनों के लिए औसत कॉलोनी गिनती चढ़ाना दक्षता और जीवित अंश की गणना के लिए इस्तेमाल किया गया था. डेटा प्राकृतिक एंटीऑक्सीडेंट तैयार के साथ एक विकिरण सुरक्षात्मक प्रभाव (संरक्षण कारक ~ 3) का संकेत दिया.
प्रतिनिधि परिणाम
| इलाज | विधि गिनती | मढ़वाया सेल | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Efficiency1 चढ़ाना | जी Fraction2 |
| इलाज कक्ष | मैनुअल (Stereomicroscope) | 100 | 19 | 22 | 38 | 14 | 20 | 0.23 | 1 |
| मैनुअल (डिजिटल छवि) | 100 | 22 | 23 | 34 | 15 | 22 | 0.23 | 1 | |
| Maxima खोजें (फिजी) | 100 | 23 | 21 | 33 | 14 | 21 | 0.22 | 1 | |
| 20 मिमी सीपीएफ़ | मैनुअल (Stereomicroscope) | 100 | 18 | 11 | 21 | 15 | 11 | 0.15 | 0.66 |
| मैनुअल (डिजिटल छवि) | 100 | 19 | 11 | 23 | 16 | 8 | 0.15 | 0.67 | |
| Maxima खोजें (फिजी) | 100 | 17 | 11 | 22 | 17 | 8 | 0.15 | 0.65 | |
| 4 Gy | मैनुअल (Stereomicroscope) | 1000 | 39 | 27 | 28 | 44 | 28 | 0.03 | 0.14 |
| मैनुअल (डिजिटल छवि) | 1000 | 42 | 33 | 31 | 42 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| Maxima खोजें (फिजी) | 1000 | 42 | 35 | 30 | 43 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| 20 मिमी + सीपीएफ़ 4 Gy | मैनुअल (Stereomicroscope) | 1000 | 115 | 105 | 98 | 108 | 101 | 0.11 | 0.47 |
| मैनुअल (डिजिटल छवि) | 1000 | 117 | 102 | 104 | 103 | 99 | 0.11 | 0.45 | |
| Maxima खोजें (फिजी) | 1000 | 121 | 102 | 104 | 102 | 97 | 0.11 | 0.47 |
1 चढ़ाना दक्षता = कालोनियों की संख्या / मढ़वाया कोशिकाओं की संख्या की गिनती
2 जी अंश = (मढ़वाया कोशिकाओं की संख्या / गिना कालोनियों की संख्या) / चढ़ाना दक्षता
टेबल चढ़ाना दक्षता और अस्तित्व और कॉलोनी की गिनती की तुलना विभिन्न तरीकों का उपयोग कर की गणना 1 .
चित्रा 1 डिजिटल छवि मानव, FEP +१,८११, 1000 कोशिकाओं के चढ़ाना और आठ दिनों के ऊष्मायन निम्नलिखित keratinocytes द्वारा उत्पादित कालोनियों दिखा. (ए) कक्ष 4 Gy के साथ विकिरणित किया गया और (बी) कोशिकाओं 20 μg / एमएल सीपीएफ़ के साथ 1 घंटे के लिए 37 ° सी पहले 4 Gy के साथ विकिरण इलाज किया गया. प्राकृतिक एंटीऑक्सीडेंट तैयार के साथ एक विकिरण सुरक्षात्मक प्रभाव स्पष्ट है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
परमाणु विज्ञान और इंजीनियरिंग के ऑस्ट्रेलियाई संस्थान का समर्थन स्वीकार किया है. TCK AINSE पुरस्कार के प्राप्तकर्ता था. Epigenomic चिकित्सा लैब राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (566,559) द्वारा समर्थित है. एचआर स्नातकोत्तर ऑस्ट्रेलियाई और BakerIDI उज्ज्वल चिंगारी पुरस्कार द्वारा समर्थित है. इस काम बायोमेडिकल इमेजिंग विकास (सीआरसी बोली) लिमिटेड की स्थापना की है और ऑस्ट्रेलियाई सरकार ने सहकारी अनुसंधान केन्द्र कार्यक्रम के अंतर्गत समर्थित के लिए सीआरसी द्वारा वित्त पोषित है. सीओ प्राप्तकर्ता एक ऑस्ट्रेलियाई पुरस्कार स्नातकोत्तर और एक अनुपूरक सीआरसी बोली छात्रवृत्ति है.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon Instruments | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
