クローン原性アッセイ：付着細胞

Summary

生殖可能性を評価するためのクローン原性アッセイの適用は50年以上のために設立されました。ここでは、接着細胞とクローン原性アッセイを行うための一般的な手順を示しています。

Abstract

クローン原性（またはコロニー形成）アッセイは、50年以上のために設立されました。テクニックを記述したオリジナルの論文は1956年¹に掲載されました。離れて方法を文書化するから、最初の画期的な研究は、培養¹のX線照射した哺乳類（HeLa細胞）細胞の最初の放射線線量応答曲線を生成する。 control未処理の細胞とそのような暴露などの様々な治療を受けた細胞の間で、基本的に、クローン原性アッセイは、生殖生存率の違い（50以上の細胞のコロニーを形成する単一のセル、すなわち子孫を生成する細胞の能力）のアセスメントが可能に電離放射線、様々な化学化合物（例えば、細胞毒性薬）や他の場合における遺伝子操作へ。アッセイは、放射線生物学で最も広く受け入れられている技術となっていると広く異なる細胞株の放射線感受性を評価するために使用されています。さらに、クローン原性アッセイは、一般的に化合物を変更する放射線の有効性を監視するために、異なる細胞株のコロニー形成能力、に細胞毒性薬と他の抗がん治療薬の効果を決定するために使用されます。接着細胞株を使用する典型的なクローン原性生存実験ではコロニーを固定し、染色つの異なるコンポーネントが、1）組織培養フラスコで細胞単層の治療、2）単一の細胞懸濁液の調製とペトリ皿と3に適切な数の細胞をプレーティング）を含む関連する潜伏期間の後、これは細胞株によっては、1〜3週間から範囲にすることができます。ここでは、不死化したヒトケラチノサイト細胞株（FEP - ^1811）2の使用で接着性細胞株をクローン原性アッセイを行うための一般的な手順を示しています。また、私たちの目的は、放射線に対する細胞の曝露後のコロニー形成率と生存率の分数の計算を含むクローン原性アッセイの共通の特徴を記述するために、そして天然の抗酸化製剤の使用と放射線応答の変更を例示することがあります。

Protocol

1。細胞培養と実験セットアップ

1. ヒトケラチノサイトは、L -グルタミン（2mM）を、上皮成長因子（5 ngのを補充したケラチノサイト- SFM（K - SFM）培地（GIBCO、無血清培地）15mLを含む75センチメートル²組織培養フラスコの単層として維持されています/ mL）を、ウシ下垂体抽出物（40μg/ mL）を、20 mg / mLのゲンタマイシン。細胞は37℃で加湿5％CO ₂環境下で栽培されています
2. 細胞は、K - SFM培地5 mLを含む12 × 25cm ^2の組織培養フラスコに播種されています。

単一の細胞懸濁液をトリプシン処理によって調製される。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、5〜10分間0.05％トリプシン/ EDTA溶液と共にインキュベートされています。細胞は丸くし、約30％が切り離されているになるために起動すると、10％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地の3倍量のトリプシンを中和するために追加されます。細胞は（20回）ピペッティングによって切り離されている。細胞を、血球計を使用してカウントされます。

適切な細胞数は細胞株の倍加時間（人間FEP - 1811ケラチノサイトで約20時間）に応じて播種されています。目的は、実験の日に〜90％コンフルエントに（フラスコあたり〜10 ⁶細胞）を達成することです。

12フラスコから成る実験では約4時間で完了することができる、単一のクローン原性アッセイ（6非照射コントロールと6つの照射フラスコ）に最適です。

2。治療と照射

1. 関連する放射線修飾化合物と適当な時間のために、細胞を扱い、電離放射線γ線またはX線のいずれかに細胞をさらす。

通常6フラスコは、コロニー形成率（未処理）と薬剤のみコントロールとして機能する。他の六フラスコが照射されています。

1時間、水溶性天然抗酸化製剤、（20μg/ mLのための代表的データを以下に示す;整合栄養補助食品国際、スプリングヒル、テネシー州、米国CPF）この例ではヒトケラチノサイトはCinnulin PFの様々な濃度で処理されています37℃細胞は^{、137 Cs}のソース（; Nordionインターナショナル、カナダ、ON、1.6 Gyの/分Gammacell 1000年エリート照射器）を使用して、4 Gyで照射されています。

3。メッキ

1. 前述のように治療後に、単一の細胞懸濁液が得られる。
2. 各サンプル中の細胞数を血球計算板を用いて慎重にカウントし、希釈されるように適切な細胞数は、ペトリ皿（5つは15mmの皿にそれぞれの複製）に播種されています。
   プレート当たり種子するセルの数を決定する際にはコロニー形成率および/または生存率が期待されるべきである。 150コロニー - 目的は、20の間の範囲を達成することです。

ペトリ皿は、加湿プラスチック製のクローニングボックスに配置し、℃でコロニー形成のために37℃、5％CO ₂環境下でインキュベートする。

コロニー形成のためのインキュベーション時間は、異なる細胞株では1〜3週間で変化する、それは時間が少なくとも6つの細胞分裂と同等でなければならないことが受け入れられている。この例では、ヒトケラチノサイトの制御料理は、8日が50以上のセルで構成される十分な大きさのクローンを形成する必要があります。

4。コロニーを固定と染色

ドラフト内で、次の手順を実行します。

1. ゆっくりと吸引によってプレートの各々からメディアを削除する。
2. 5mLの0.9％生理食塩水で各プレートを洗浄してください。
3. 15〜30分間5 mLを10％中性緩衝ホルマリン液でコロニーを修正。
4. 30〜60分間のdH ₂ Oで希釈した5 mLの0.01％（w / v）のクリスタルバイオレットで染色。
5. のdH ₂ Oで過剰クリスタルバイオレットを洗い、皿が乾燥することができます。

5。コロニー計数

実体顕微鏡

1. 50以上の個々の細胞を含むコロニーを実体顕微鏡を使用してカウントされます。

イメージングソフトウェアを使用して、デジタルイメージングとカウント

1. コロニーのデジタル画像は、カメラやスキャン装置を用いて得られ
2. コロニーは、下記のように画像解析ソフトウェアパッケージを使用してカウントされます。

ImageJの（フィジーバージョン1.44A）を使用して細胞計数

1. フィジーでの画像ファイルを開いて、ファイルにアクセスしてください - >開く。
2. >調整...->しきい値 - 必要な8ビットフォーマットに画像を変換する場合、画像にアクセスしてください。
3. 唯一のコロニーが検出されるように非特異的なバックグラウンドのレベルを低減するためのしきい値を調整します。
4. 次のコマンドを使用してコロニーをカウント：プロセスに行く - >バイナリ - >最大値を検索。

この画像形式の場合は、ノイズ耐性は0に設定することができます。その明るい背景のオプションがチェックされていることを確認し、すべての細胞コロニーが正しく登録されていることを確認するために検出された最大値をプレビューします。

Discussion

この例では、人間のFEP - 1811ケラチノサイトは、最大100μg/ mLのCPFへの種々の濃度で処理した、データは37℃で1時間に20μg/ mLのCPF℃であるために示されています治療後の細胞は^{、137 Cs}のソース（; Nordionインターナショナル、カナダ、ON、1.6 Gyの/分Gammacell 1000年エリート照射器）を使用して、4 Gyで照射した。制御のために未処理と薬剤のみの治療法100個の細胞は、それぞれのペトリ皿に播種したとディッシュあたり1000個の細胞は、照射試料のためにプレートした。上記の表に示すように、コロニーを実体顕微鏡またはデジタル画像（図1）を用いてカウントしたImageJを用いて計数のために採取した。 five皿の平均コロニー数は、コロニー形成率と生存率を計算するために使用されていました。データは、天然の抗酸化製剤で放射線防護効果（保護因子〜3）を示した。

代表的な結果

治療	計数方法	メッキ細胞	1	2	3	4	5	メッキEfficiency1	生き残った Fraction2
未処理の細胞	マニュアル （実体顕微鏡）	100	19	22	38	14	20	0.23	1
	マニュアル （デジタル画像）	100	22	23	34	15	22	0.23	1
	マキシマを見つける （フィジー）	100	23	21	33	14	21	0.22	1
20 mMのCPF	マニュアル （実体顕微鏡）	100	18	11	21	15	11	0.15	0.66
	マニュアル （デジタル画像）	100	19	11	23	16	8	0.15	0.67
	マキシマを見つける （フィジー）	100	17	11	22	17	8	0.15	0.65
4 Gyの	マニュアル （実体顕微鏡）	1000年	39	27	28	44	28	0.03	0.14
	マニュアル （デジタル画像）	1000年	42	33	31	42	31	0.04	0.16
	マキシマを見つける （フィジー）	1000年	42	35	30	43	31	0.04	0.16
20mMのCPF + 4 Gyの	マニュアル （実体顕微鏡）	1000年	115	105	98	108	101	0.11	0.47
	マニュアル （デジタル画像）	1000年	117	102	104	103	99	0.11	0.45
	マキシマを見つける （フィジー）	1000年	121	102	104	102	97	0.11	0.47

コロニーの¹めっき効率=数は播種した細胞の/数をカウント
²生存率=（播種した細胞の数/カウントコロニー数）/コロニー形成率

表1。メッキの効率と生存率の計算と様々な方法を用いてコロニー数の比較

図1人間、FEP - 1811、1000個の細胞のプレーティングと8日間のインキュベーション後のケラチノサイトによって生成されたコロニーを示すデジタル画像。 （A）細胞は、4 Gyで照射され、（B）細胞を4 Gyで° C照射前に37℃で1時間に20μg/ mLのCPFで処理した。天然の抗酸化製剤と放射線防護効果は明ら​​かである。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte-serum free medium	Growth medium	Invitrogen	17005042	Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract.
Trypsin-EDTA		Invitrogen	15400-054	0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+.
Dulbecco’s modified essential medium	Growth medium	Invitrogen	11885-084	Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA.
0.09% Saline	Solution			Used to wash colonies.
10% Neutral buffered formalin solution	Solution	Sigma-Aldrich	HT501128	~4% formaldehyde; used to fix colonies.
Crystal violet	Powder	SPI Supplies	02577-MB	0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies.
Gammacell 1000 elite irradiator		Nordion International Inc.
Petri dishes	60 x 15 mm	Falcon BD	353002
Haemocytometer		Hawksley; Medical and Laboratory Equipment	AC1000
Cloning box				Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation.
Stereomicroscope	Type 102	Nikon Instruments		Used to count colonies consisting of >50 cells.