Summary
생식 가능성을 평가하기위한 clonogenic 분석의 응용은 이상의 50 년 동안 설립되었습니다. 여기 자기편 세포와 clonogenic 분석을 수행하기위한 일반적인 절차를 보여줍니다.
Abstract
clonogenic (또는 콜로니 형성) 분석은 이상의 50 년 동안 설립되었습니다, 기술을 설명하는 원래의 논문은 1956 1이 공개되었습니다. 분리 방법을 문서화에서 최초 획기적인 연구 문화 1 X - 선 조사 포유 동물 (헬라) 세포에 대한 최초의 방사선 선량 - 반응 곡선을 생성. 제어 치료 세포와 같은 노출 등 다양한 트리 트먼트를받은 세포 사이에, 기본적으로 clonogenic 분석은 생식 생존의 차이 (50 이상 세포의 식민지를 형성하는 하나의 세포 즉 자손을 만들어 세포의 능력)의 평가를 수 방사선을 이온화하는 다양한 화합물 (예 : 세포 독성 대리인) 또는 그 밖의 경우에는 유전자 조작. 분석은 방사선 생물학에서 가장 널리 인정 기술되어 널리 다른 세포 라인의 방사선 감도를 평가에 사용되고 있습니다. 또한, clonogenic 분석은 일반적으로 방사선 수정 화합물의 효능을 모니터링하고 다른 세포 라인의 콜로니 형성 능력에 세포 독성 에이전트 및 다른 안티 암 치료제의 효과를 결정하는 데 사용됩니다. 자기편 세포 라인을 사용하는 전형적인 clonogenic 서바이벌 실험 식민지를 해결하고 얼룩 세 개의 서로 다른 구성 요소 1) 조직 문화 flasks의 세포 monolayer 치료, 2) 단일 세포 suspensions의 준비 및 배양 접시와 3 세포의 적절한 숫자를 도금)을 포함 관련 잠복기 다음, 이것은 세포 라인에 따라, 1-3 주에서 범위 수 있습니다. 여기서 우리는 영원히 인간 keratinocyte 세포 라인의 사용 (FEP - 1811) 2 자기편 세포 라인 clonogenic 분석을 수행하기위한 일반적인 절차를 보여줍니다. 또한, 우리의 목적은 방사선 세포의 노출 후 도금 효율성과 생존 분수의 계산을 포함 clonogenic의 assays의 일반적인 기능을 설명하고, 천연 항산화 제제의 사용과 방사선 반응의 수정을 예시하는 것입니다.
Protocol
1. 세포 배양 및 실험 설정
- 인간 keratinocytes는 keratinocyte - SFM 15 ML (K - SFM)이있는 75cm 두 조직 문화 flasks에 monolayers로 유지 L - 글루타민 (2 ㎜), 표피 성장 인자 (5 NG와 보충 매체 (GIBCO, 혈청이없는 배지) / ML), 소 뇌하수체 추출 (40 μg / ML) 20 MG / ML gentamicin. 세포 ° C.에게 37 humidified 5 % CO 2 환경에서 재배
- 전지는 K - SFM 매체의 5 ML을 포함 12 X 25cm 두 조직 문화 flasks에 씨앗을 품고 있습니다.
단세포 suspensions는 trypsinization에 의해 준비가되어 있습니다. 세포는 칼륨이 염분 버퍼와 세탁 및 50~10분에 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 incubated 있습니다. 세포가되기 시작하면 반올림과 ~ 30 %가 떨어뜨려 10 % 태아 소 혈청이 포함된 Dulbecco의 수정 독수리 매체 3 볼륨이 트립신을 중화에 추가됩니다. 세포는 (20 번)와 아래로 pipetting에 의해 떨어뜨려졌다. 세포는 hemocytometer를 사용하여 계산됩니다.
적절한 셀 번호는 세포주 (인간 FEP - 1811 keratinocytes에 대한 약 20 시간)의 두 배로 시간에 따라 씨앗을 품고 있습니다. 목적은 실험 당일 ~ 90 % confluency을 (술병 회 ~ 10 6 세포) 달성하는 것입니다.
12 flasks 구성 실험 약 4 시간에 완료할 수 단일 clonogenic 분석 (6 unirradiated 제어 여섯 조사 flasks)에 최적입니다.
2. 치료 및 조사
- 관련 방사선 - 수정 화합물과 적절한 시간에 세포를 치료하고 이온화 방사선 γ - 방사선 또는 X - 선 중 하나에 세포를 노출.
일반적으로 여섯 flasks는 도금 효율 (치료)와 약물에만 컨트롤로 제공하고 있습니다. 다른 여섯 flasks가 조사하고 있습니다.
1 시간, 수용성 천연 항산화 제제,이 예제에서 인간 keratinocytes는 Cinnulin PF의 다양한 농도 (20 μg / ML은 아래와 같습니다에 대한 대표적인 데이터를,, 무결성 Nutraceuticals 국제, 스프링 힐, TN, 미국 CPF)로 처리됩니다 37 ° C. 세포는 137 고사 소스를 (; Nordion 국제, ON, 캐나다, 1.6 쥐 / 분 Gammacell 1000 엘리트 irradiator)를 사용하여 4 쥐와 함께 조사하고 있습니다.
3. 도금
- 앞에서 설명한로 치료에 따라, 단일 셀 suspensions을 얻을 수 있습니다.
- 각각의 샘플에있는 세포의 숫자는 신중하게 hemocytometer를 사용하여 계산과 같은 것이 적절한 세포 번호가 (5가 15mm 요리 각각의 복제) 배양 접시에 씨앗을 품고 아르 희석 수 있습니다.
판 당 종자로 세포의 수를 결정할 때 도금 효율 및 / 또는 분수에서 살아남는은 예상해야합니다. 150 식민지 - 목표는 20 ~의 범위를 달성하는 것입니다.
배양 접시는 humidified 플라스틱 복제 상자에서 정렬 및 ° C 콜로니 형성 37 5 % CO 2 환경에서 incubated입니다.
콜로니 형성을위한 인큐베이션 시간이 서로 다른 세포 라인 1-3 주간 다릅니다, 그것은 시간이 적어도 6 셀 부문에 해당되어야 인정합니다. 이 예제에서는, 인간 keratinocytes에 대한 제어 요리 팔일 50 개 이상의 세포로 이루어진 충분히 많은 클론을 형성해야합니다.
4. 식민지를 해결하고 스테 이닝
펌 후드에서 다음 단계를 완료합니다.
- 부드럽게 흡인하여 접시의 각 미디어를 제거합니다.
- 5 ML 0.9 %의 식염수에 각각의 접시를 씻으십시오.
- 15-30분 5 ML 10% 중립 버퍼 포르말린 용액으로 식민지를 수정.
- 30~60분에 대한 DH 2 O 5 ML 0.01 % (W / V) 크리스탈 바이올렛과 얼룩.
- DH 2 O와 함께 여분의 크리스탈 바이올렛 씻고 요리 건조 수 있습니다.
5. 콜로니 카운팅
Stereomicroscope
- 50 개 이상의 개별 세포를 포함하는 식민지가 stereomicroscope를 사용하여 계산됩니다.
이미징 소프트웨어를 사용하여 디지털 이미징과 카운트
- 식민지의 디지털 이미지는 카메라를 사용하거나 장치를 스캐닝를 얻을 수있다
- 식민지은 아래 설명 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 계산됩니다.
ImageJ (피지 버전 1.44a)를 사용하여 셀 카운트
- 피지에있는 이미지 파일을 열고, 파일 이동 -> 엽니다.
- > 조정 ...-> 임계값 - 8 비트 형식으로 이미지를 변환 필요한 경우, 이미지로 이동합니다.
- 오직 식민지가 감지되도록 불특정 배경 수준을 줄이기 위해 임계값을 조정합니다.
- 다음을 사용하여 식민지를 카운트 : 프로세스로 이동 -> 이진 -> 맥시멈를 찾습니다.
이 이미지 포맷에 대한 소음의 허용 오차는 0으로 설정할 수 있습니다. 저기 저 반짝 이는 불빛 배경 옵션을 쳤다되었는지 확인하고 모든 세포 식민지가 올바르게 등록되었는지 확인하기 위해 감지된 맥시멈를 미리 봅니다.
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Discussion
이 예제에서는 인간 FEP - 1811 keratinocytes 100 μg / ML CPF에 다양한 농도와 치료를했다, 데이터는 37에서 1 시간 20 μg / ML CPF ° C.에 대해 표시됩니다 다음 치료 세포는 137 고사 소스를 (; Nordion 국제, ON, 캐나다, 1.6 쥐 / 분 Gammacell 1000 엘리트 irradiator)를 사용하여 4 쥐와 함께 조사했다. 컨트롤에 대한 치료 및 약물 치료에만 100 세포는 각 배양 접시에있는 도금되었으며 요리 1000 세포가 조사 샘플 도금했다. 위의 표에 표시, 식민지는 stereomicroscope 또는 디지털 이미지 (그림 1)를 사용하여 계산되었습니다 ImageJ를 사용하여 계산을 위해 이동했다. 다섯 가지 요리에 대한 평균 콜로니 개수는 도금 효율과 살아남은 소수를 계산하는 데 사용되었다. 데이터는 천연 항산화 제제와 방사선 보호 효과 (보호 요소 ~ 3)을 지적했다.
대표 결과
| 치료 | 방법도 포함 해서요 | 도금 셀 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 도금 Efficiency1 | 살아 Fraction2 |
| 치료 세포 | 수동 (stereomicroscope) | 100 | 19 | 22 | 38 | 14 | 20 | 0.23 | 1 |
| 수동 (디지털 이미지) | 100 | 22 | 23 | 34 | 15 | 22 | 0.23 | 1 | |
| 맥시마 찾기 (피지) | 100 | 23 | 21 | 33 | 14 | 21 | 0.22 | 1 | |
| 20 MM CPF | 수동 (stereomicroscope) | 100 | 18 | 11 | 21 | 15 | 11 | 0.15 | 0.66 |
| 수동 (디지털 이미지) | 100 | 19 | 11 | 23 | 16 | 8 | 0.15 | 0.67 | |
| 맥시마 찾기 (피지) | 100 | 17 | 11 | 22 | 17 | 8 | 0.15 | 0.65 | |
| 4 쥐 | 수동 (stereomicroscope) | 1000 | 39 | 27 | 28 | 44 | 28 | 0.03 | 0.14 |
| 수동 (디지털 이미지) | 1000 | 42 | 33 | 31 | 42 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| 맥시마 찾기 (피지) | 1000 | 42 | 35 | 30 | 43 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| 20 MM CPF + 4 쥐 | 수동 (stereomicroscope) | 1000 | 115 | 105 | 98 | 108 | 101 | 0.11 | 0.47 |
| 수동 (디지털 이미지) | 1000 | 117 | 102 | 104 | 103 | 99 | 0.11 | 0.45 | |
| 맥시마 찾기 (피지) | 1000 | 121 | 102 | 104 | 102 | 97 | 0.11 | 0.47 |
1 도금 효율이 식민지의 = 숫자는 도금 세포의 / 숫자를 계산
이 살아남는 분율 = (도금 세포의 / 번호 계산 식민지 개수) / 도금 효율
도금 효율과 생존과 다양한 방법을 사용하여 식민지 카운트의 비교 표 1. 계산
그림 1. 인간, FEP - 1811, 1000 세포의 도금 및 8 일 보육 다음 keratinocytes 제작한 식민지를 보여주는 디지털 이미지. (A) 전지 4 쥐로 조사되었으며 (B) 세포 ° C 이전 4 쥐와 조사 37 1 시간 20 μg / ML CPF로 치료했다. 천연 항산화 제제와 방사선 보호 효과는 분명하다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
원자력 과학 및 공학의 호주 연구소의 지원 인정받고 있습니다. TCK는 AINSE 보너스받는했다. Epigenomic 의학 연구소는 국민 건강과 호주의 의료 연구위원회 (566559)에 의해 지원됩니다. HR은 대학원 호주와 BakerIDI 밝은 점화 수상에 의해 지원됩니다. 이 작품은 바이오 메디컬 이미징 개발 회사 (CRC - 입찰가) 설립과 호주 정부의 협동 연구 센터 프로그램에 따라 지원을 위해 CRC에 의해 자금입니다. CO는 호주 대학원 보너스 및 CRC - 입찰 보조 장학금받는 사람입니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon Instruments | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
