Summary
A aplicabilidade do ensaio clonogênica na avaliação de viabilidade reprodutiva foi estabelecida há mais de 50 anos. Aqui demonstramos o procedimento geral para a realização do teste clonogênica com células aderentes.
Abstract
O clonogênica ensaio (ou formadoras de colônia) foi estabelecida há mais de 50 anos; o papel original que descreve a técnica foi publicada em 1956 1. Além de documentar o método, o estudo marco inicial gerada a curva de resposta primeira dose de radiação de raios-X de mamíferos irradiados (HeLa) células em cultura 1. Basicamente, o ensaio clonogênica permite uma avaliação das diferenças de viabilidade reprodutiva (capacidade das células de produzir descendentes, ou seja, uma única célula para formar uma colônia de 50 ou mais células) entre as células controle não tratadas e as células que sofreram vários tratamentos, como a exposição a radiação ionizante, vários compostos químicos (por exemplo, agentes citotóxicos) ou em outros casos, a manipulação genética. O ensaio tornou-se a técnica mais aceita na biologia de radiação e tem sido amplamente utilizada para avaliar a sensibilidade à radiação de linhas de células diferentes. Além disso, o ensaio clonogênica é comumente usado para monitorar a eficácia de compostos de radiação modificando e para determinar os efeitos de agentes citotóxicos e outros anti-câncer terapêuticas sobre a capacidade formadora de colônia, em linhas de células diferentes. A experiência de sobrevivência típico clonogênica usando linhas de células aderentes envolve três componentes distintos, 1) o tratamento da monocamada de células em frascos de cultura de tecidos, 2) a preparação de suspensões de células individuais e revestimento de um número adequado de células em placas de petri e 3) de fixação e coloração colônias após um período de incubação relevante, que pode variar de 1-3 semanas, dependendo da linha celular. Aqui demonstramos o procedimento geral para a realização do teste clonogênica com linhas de células aderentes com o uso de uma linha celular imortalizada dos queratinócitos humanos (FEP-1811) 2. Além disso, nossos objetivos são descrever características comuns de ensaios clonogênica incluindo o cálculo da eficiência revestimento e frações de sobrevivência após a exposição das células à radiação, e para exemplificar a modificação da radiação-resposta com o uso de uma formulação antioxidante natural.
Protocol
1. Cultura de células e Experimental Set-up
- Queratinócitos humanos são mantidos como monocamadas em 75 cm 2 frascos de cultura de tecidos contendo 15 mL de queratinócitos-SFM (K-SFM), médio (GIBCO, sem soro médio) suplementada com L-glutamina (2 mM), fator de crescimento epidérmico (5 ng / mL), extrato de hipófise bovina (40 mg / mL) e 20 mg / mL de gentamicina. As células são cultivadas em um 5% CO 2 umidificado ambiente a 37 ° C.
- Células são semeadas em 12 x 25 cm 2 frascos de cultura de tecidos contendo 5 mL de K-SFM médio.
Suspensões de células individuais são preparados por tripsinização. As células são lavadas com solução fisiológica tamponada e incubados com uma solução de tripsina 0,05% / EDTA por 5-10 minutos. Quando as células começam a se tornar arredondado e ~ 30% são individual, com 3 volumes de meio de Dulbecco modificado da águia contendo 10% de soro fetal bovino é adicionado para neutralizar o tripsina. As células são separadas por pipetagem cima e para baixo (20 vezes). As células são contadas usando um hemocitômetro.
Número de células apropriadas são semeados de acordo com o tempo de duplicação da linha celular (aproximadamente 20 horas para humanos FEP-1811 queratinócitos). O objetivo é alcançar a confluência ~ 90% (~ 10 6 células por frasco) no dia do experimento.
Um experimento composto por 12 frascos é ideal para um ensaio clonogênica única (seis controle não irradiado e seis frascos irradiados), que pode ser concluído em aproximadamente quatro horas.
2. Tratamento e irradiação
- Tratar células durante tempo suficiente com um composto de radiação de modificação relevante e expor as células à radiação ionizante ou radiação γ ou raios-X.
Tipicamente seis frascos servem como revestimento de eficiência (sem tratamento) e controles única droga. Os outros seis frascos são irradiados.
Neste exemplo queratinócitos humanos são tratados com a concentração de vários Cinnulin PF (CPF; Nutraceuticals Integrity International, Spring Hill, TN, EUA; dados representativos para 20 mcg / mL é mostrada abaixo), uma formulação hidrossolúvel antioxidante natural, por 1 hora a 37 ° C. Células são irradiados com 4 Gy usando uma fonte de 137 Cs (Gammacell irradiador 1000 Elite; Nordion International, ON, Canadá; 1,6 Gy / min).
3. Galvanização
- Após o tratamento, suspensões única célula são obtidas como descrito anteriormente.
- O número de células em cada amostra são contados com cuidado utilizando um hemocitômetro e diluído de tal forma que o número de células apropriadas são semeados em placas de Petri (cinco repetições de cada um em 15 pratos mm).
O revestimento de eficiência e / ou fração sobrevivente deve ser antecipado ao decidir o número de células de sementes por placa. O objetivo é alcançar uma faixa entre 20-150 colônias.
Placas de Petri são dispostos em uma caixa de clonagem umidificado plástico e incubadas em ambiente de 5% CO 2 a 37 ° C para a formação de colônia.
O tempo de incubação para a formação de colônia varia de 1-3 semanas para as linhas de células diferentes, é aceito que o tempo deve ser equivalente a pelo menos seis divisões celulares. Neste exemplo, os pratos de controle para queratinócitos humanos exigem oito dias para formar clones suficientemente grande composta por 50 ou mais células.
4. Fixação e coloração Colônias
Conclua as seguintes etapas em uma capela.
- Remova cuidadosamente os meios de comunicação de cada uma das placas por aspiração.
- Lavar cada placa com 5 mL solução salina 0,9%.
- Corrigir as colônias com 5 mL de solução-tampão de 10% de formalina neutra por 15-30 minutos.
- Mancha com 5 mL de cristal violeta 0,01% (w / v) em dH 2 O por 30-60 minutos.
- Lavar o excesso de cristal violeta com dH 2 O e permitir que os pratos para secar.
5. Contando colônia
Estereomicroscópio
- Colônias com mais de 50 células individuais são contados em um estereomicroscópio.
Imagem digital e contando com software de imagem
- Imagens digitais das colônias são obtidas usando uma câmera ou o dispositivo de digitalização
- Colónias são contadas usando pacotes de software de análise de imagem, como descrito abaixo.
Contagem de células usando ImageJ (Fiji versão 1.44a)
- Abra o arquivo de imagem em Fiji, vá ao menu Arquivo -> Open.
- Se for necessário converter a imagem para 8 bits formato, vá para Image -> Adjust Threshold ...->.
- Ajuste o limiar para reduzir os níveis de não-específico de fundo de modo que somente as colônias são detectados.
- Contagem de colônias usando o seguinte: vá para Processo - Binary> -> Localizar maxima.
Para este formato de imagem, tolerância ao ruído pode ser definido como 0. Garantir que a opção luz de fundo está marcada e visualizar o maxima detectada para verificar se todas as colônias de células têm sido registrado corretamente.
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Discussion
Neste exemplo humano FEP-1811 queratinócitos foram tratados com diferentes concentrações de até 100 mcg / mL CPF; dados são apresentados por 20 mcg / mL CPF para 1 hora a 37 ° C. Células após o tratamento foram irradiados com 4 Gy usando uma fonte de 137 Cs (Gammacell irradiador 1000 Elite; Nordion International, ON, Canadá; 1,6 Gy / min). Para o controle não tratado e de drogas tratamentos apenas 100 células foram semeadas em cada placa de Petri e 1000 células por placa foram banhados para as amostras irradiadas. Como indicado na tabela acima, as colônias foram contadas utilizando um estereomicroscópio ou imagens digitais (Fig. 1) foram levados para a contagem usando ImageJ. A contagem de colônias média para os cinco pratos foi usado para calcular a eficiência revestimento e fração sobrevivente. Os dados indicaram um efeito de radiação de proteção (fator de proteção ~ 3) com a formulação antioxidante natural.
Resultados representante
| Tratamento | Método de contagem | Celular folheado | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Chapeamento Efficiency1 | Sobreviventes Fraction2 |
| As células não tratadas | Manual (Estereomicroscópio) | 100 | 19 | 22 | 38 | 14 | 20 | 0,23 | 1 |
| Manual (Imagem digital) | 100 | 22 | 23 | 34 | 15 | 22 | 0,23 | 1 | |
| Encontrar Maxima (Fiji) | 100 | 23 | 21 | 33 | 14 | 21 | 0,22 | 1 | |
| 20 mM CPF | Manual (Estereomicroscópio) | 100 | 18 | 11 | 21 | 15 | 11 | 0,15 | 0,66 |
| Manual (Imagem digital) | 100 | 19 | 11 | 23 | 16 | 8 | 0,15 | 0,67 | |
| Encontrar Maxima (Fiji) | 100 | 17 | 11 | 22 | 17 | 8 | 0,15 | 0,65 | |
| 4 Gy | Manual (Estereomicroscópio) | 1000 | 39 | 27 | 28 | 44 | 28 | 0,03 | 0,14 |
| Manual (Imagem digital) | 1000 | 42 | 33 | 31 | 42 | 31 | 0,04 | 0,16 | |
| Encontrar Maxima (Fiji) | 1000 | 42 | 35 | 30 | 43 | 31 | 0,04 | 0,16 | |
| 20 mM CPF + 4 Gy | Manual (Estereomicroscópio) | 1000 | 115 | 105 | 98 | 108 | 101 | 0,11 | 0,47 |
| Manual (Imagem digital) | 1000 | 117 | 102 | 104 | 103 | 99 | 0,11 | 0,45 | |
| Encontrar Maxima (Fiji) | 1000 | 121 | 102 | 104 | 102 | 97 | 0,11 | 0,47 |
Uma eficiência Plating = número de colônias contadas / número de células plaqueadas
2 fração Surviving = (número de colônias contadas / número de células banhado) / eficiência plating
Cálculo tabela 1. Eficiência de revestimento e de sobrevivência e comparação da contagem de colônias usando vários métodos
Figura 1. Imagem digital mostrando colônias produzido por humanos, FEP-1811, queratinócitos seguintes chapeamento de 1000 células e oito dias de incubação. (A) As células foram irradiadas com 4 Gy e (B) as células foram tratadas com 20 mcg / mL CPF para 1 hora a 37 ° C antes da irradiação com 4 Gy. Um efeito da radiação com a formulação de proteção antioxidante natural é evidente.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O apoio do Instituto Australiano de Ciência Nuclear e Engenharia é reconhecido. TCK foi o ganhador de prêmios AINSE. Lab Medicine epigenômico é suportado pelo National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). HR é suportado por um australiano de pós-graduação e prêmios BakerIDI faísca brilhante. Este trabalho é financiado pelo CRC para Biomédica imagem Development Ltd (CRC-BID), criado e apoiado no âmbito do Governo australiano da Cooperativa programa Centros de Pesquisa. CO é o destinatário um prêmio de pós-graduação da Austrália e uma bolsa de estudos complementares CRC BID.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon Instruments | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
