Summary
La aplicabilidad del ensayo para evaluar la viabilidad clonigénicas reproductiva se ha establecido desde hace más de 50 años. Aquí se demuestra el procedimiento general para llevar a cabo el ensayo clonogénico con células adherentes.
Abstract
El clonigénicas (o formadoras de colonias) de ensayo se ha establecido desde hace más de 50 años, el documento original que describe la técnica se publicó en 1956 1. Aparte de la documentación del método, el estudio de referencia inicial generó la primera dosis de radiación curva de respuesta de rayos X irradiados mamíferos (HeLa) las células en cultivo 1. Básicamente, el ensayo clonogénico permite una evaluación de las diferencias en la viabilidad de la reproducción (la capacidad de las células para producir descendencia, es decir, una sola célula para formar una colonia de 50 o más células) entre las células control no tratadas y las células que han sido sometidos a diversos tratamientos, como la exposición a las radiaciones ionizantes, diversos compuestos químicos (por ejemplo, agentes citotóxicos) o en otros casos la manipulación genética. El ensayo se ha convertido en la técnica más ampliamente aceptada en biología de la radiación y ha sido ampliamente utilizada para evaluar la sensibilidad a la radiación de las diferentes líneas celulares. Además, el ensayo clonogénico se utiliza comúnmente para controlar la eficacia de los compuestos de la radiación y la modificación para determinar los efectos de los agentes citotóxicos y otras terapias contra el cáncer en la capacidad de formación de colonias, en diferentes líneas celulares. Un típico experimento clonigénicas supervivencia utilizando líneas de células adherentes consta de tres componentes distintos: 1) el tratamiento de la monocapa celular en frascos de cultivo de tejidos, 2) la preparación de suspensiones de células individuales y las planchas de un número adecuado de células en placas de Petri y 3) la fijación y la tinción de las colonias después de un período de incubación correspondiente, que podría oscilar entre 1-3 semanas, dependiendo de la línea celular. Aquí se demuestra el procedimiento general para llevar a cabo el ensayo clonogénico con líneas de células adherentes con el uso de un inmortalizado línea celular humana de queratinocitos (FEP-1811) 2. Además, nuestros objetivos son describir las características comunes de los ensayos clonogénicos incluyendo el cálculo de la eficiencia de plaqueo y las fracciones de la supervivencia después de la exposición de las células a la radiación, y para ejemplificar la modificación de la radiación de respuesta con el uso de una formulación antioxidante natural.
Protocol
1. Cultivo de células y experimental puesta en marcha
- Queratinocitos humanos se mantienen como monocapas en 75 cm 2 frascos de cultivo de tejidos que contienen 15 ml de queratinocitos-SFM (K-SFM) (GIBCO, medio libre de suero), complementado con L-glutamina (2 mM), factor de crecimiento epidérmico (5 ng / mL), extracto de pituitaria bovina (40 pg / ml) y gentamicina 20 mg / ml. Las células se cultivan en un humidificado 5% de CO2 el medio ambiente a 37 ° C.
- Se siembran las células en 12 x 25 cm 2 frascos de cultivo de tejidos que contienen 5 ml de K-SFM medio.
Suspensiones de células individuales son preparadas por tripsinización. Las células se lavan con tampón fosfato salino y se incubaron con un 0,05% de tripsina / EDTA durante 5-10 minutos. Cuando las células empiezan a ser redondeados y aproximadamente el 30% son separados, 3 volúmenes de Dulbecco modificado medio de Eagle con 10% de suero fetal bovino se agrega para neutralizar la tripsina. Las células se separan por pipeteando arriba y abajo (20 veces). Las células se contaron usando un hemocitómetro.
Un número adecuado de células son clasificados de acuerdo con el tiempo de duplicación de la línea celular (aproximadamente 20 horas para el consumo humano FEP-1811 queratinocitos). El objetivo es lograr la confluencia de ~ 90% (~ 10 6 células por frasco) en el día del experimento.
Un experimento que consta de 12 frascos es óptimo para un solo ensayo clonogénico (seis de control no irradiados y seis frascos irradiados) que puede ser completado en aproximadamente cuatro horas.
2. El tratamiento y la irradiación
- Tratamiento de las células durante el tiempo necesario con una relevante modificación de la radiación compuesto y exponer las células a las radiaciones ionizantes o γ-radiación o radiografías.
Por lo general seis frascos servir como eficiencia de plaqueo (sin tratamiento) y los controles de drogas solamente. Los otros seis frascos son irradiados.
En este ejemplo, los queratinocitos humanos son tratados con distintas concentraciones de Cinnulin PF (CPF; Nutracéuticos Internacional de Integridad, Spring Hill, TN, EE.UU., los datos representativos de 20 mg / ml se muestra a continuación), soluble en agua formulación antioxidante natural, durante 1 hora a 37 ° C. Las células son irradiadas con 4 Gy utilizando una fuente de 137 Cs (Gammacell 1000 irradiador Elite; Nordion Internacional, ON, Canadá; 1,6 Gy / min).
3. Enchapado
- Después del tratamiento, suspensiones de células individuales se obtienen como se describió anteriormente.
- El número de células en cada muestra se contó con cuidado utilizando un hemocitómetro y se diluye de tal manera que el número de células apropiadas se siembran en placas de Petri (cinco réplicas de cada uno en 15 mm platos).
Las planchas de eficiencia y / o sobrevivientes fracción debe preverse la hora de decidir el número de células a las semillas por placa. El objetivo es alcanzar un rango de entre 20 a 150 colonias.
Placas de Petri están dispuestos en una caja de plástico de la clonación humidificado y se incubaron en un 5% de CO2 el medio ambiente a 37 ° C para la formación de colonias.
El tiempo de incubación para la formación de colonias varía de 1-3 semanas para las líneas celulares diferentes, se acepta que el tiempo debe ser equivalente a por lo menos seis divisiones celulares. En este ejemplo, los platos de control de los queratinocitos humanos requieren ocho días para formar clones lo suficientemente grande que consta de 50 o más células.
4. Fijación y tinción de las colonias
Complete los siguientes pasos en una campana extractora.
- Retire con cuidado los medios de comunicación de cada una de las placas por aspiración.
- Lave cada placa con 5 ml de solución salina al 0,9%.
- Fijar las colonias con 5 ml de 10% neutral solución de formalina tamponada durante 15-30 minutos.
- Mancha con 5 ml 0,01% (w / v) de cristal violeta en dH 2 O durante 30-60 minutos.
- Lavar el exceso de cristal violeta con dH 2 O y deje que los platos se sequen.
5. Recuento de colonias
Estereomicroscopio
- Las colonias que contienen más de 50 células individuales se cuentan utilizando un microscopio estereoscópico.
La imagen digital y contar con software de imágenes
- Las imágenes digitales de las colonias se han obtenido utilizando una cámara o un dispositivo de escaneo
- Se cuentan las colonias utilizando imágenes de los paquetes de software de análisis como se describe a continuación.
Conteo de células con ImageJ (Fiji Versión 1.44a)
- Abra el archivo de imagen en Fiji, vaya a Archivo -> Abrir.
- Si es necesario convertir la imagen en formato de 8 bits, vaya a Imagen -> Ajustar umbral ...->.
- Ajuste de umbral para reducir los niveles de fondo no específica de manera que sólo las colonias se detectan.
- Contar las colonias con lo siguiente: Ir al proceso - binario> -> Buscar máximos.
Para este formato de imagen, la tolerancia al ruido puede ser ajustado a 0. Asegúrese de que la opción de fondo claro está marcada y vista previa de la máxima detectada para comprobar que todas las colonias de células se han registrado correctamente.
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Discussion
En este ejemplo humano FEP-1811 queratinocitos fueron tratadas con diferentes concentraciones de hasta 100 mg / mL ACB, se muestran los datos de 20 mg / ml ACB durante 1 hora a 37 ° C. Después de celdas de tratamiento fueron irradiados con 4 Gy utilizando una fuente de 137 Cs (Gammacell 1000 irradiador Elite; Nordion Internacional, ON, Canadá; 1,6 Gy / min). Para los tratamientos de control no tratado sólo de drogas y 100 células fueron sembradas en cada placa de Petri y 1000 células por placa se colocaron para las muestras irradiadas. Como se indica en el cuadro anterior, las colonias se contaron usando un microscopio estereoscópico o imágenes digitales (Fig. 1) se tomaron para contar con ImageJ. El recuento promedio de los cinco platos se utilizó para calcular la eficiencia de placas y la fracción de supervivientes. Los datos indicaron un efecto de la radiación de protección (factor de protección ~ 3) con la formulación antioxidante natural.
Resultados representante
| Tratamiento | Método de recuento | Celular plateado | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Revestimiento Efficiency1 | Sobreviviente Fraction2 |
| Las células no tratadas | Manual (Microscopio estereoscópico) | 100 | 19 | 22 | 38 | 14 | 20 | 0.23 | 1 |
| Manual (Imagen digital) | 100 | 22 | 23 | 34 | 15 | 22 | 0.23 | 1 | |
| Buscar Maxima (Fiji) | 100 | 23 | 21 | 33 | 14 | 21 | 0.22 | 1 | |
| 20 mM ACB | Manual (Microscopio estereoscópico) | 100 | 18 | 11 | 21 | 15 | 11 | 0.15 | 0.66 |
| Manual (Imagen digital) | 100 | 19 | 11 | 23 | 16 | 8 | 0.15 | 0.67 | |
| Buscar Maxima (Fiji) | 100 | 17 | 11 | 22 | 17 | 8 | 0.15 | 0.65 | |
| 4 Gy | Manual (Microscopio estereoscópico) | 1000 | 39 | 27 | 28 | 44 | 28 | 0.03 | 0.14 |
| Manual (Imagen digital) | 1000 | 42 | 33 | 31 | 42 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| Buscar Maxima (Fiji) | 1000 | 42 | 35 | 30 | 43 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| 20 mM ACB + 4 Gy | Manual (Microscopio estereoscópico) | 1000 | 115 | 105 | 98 | 108 | 101 | 0.11 | 0.47 |
| Manual (Imagen digital) | 1000 | 117 | 102 | 104 | 103 | 99 | 0.11 | 0.45 | |
| Buscar Maxima (Fiji) | 1000 | 121 | 102 | 104 | 102 | 97 | 0.11 | 0.47 |
Una eficiencia de plaqueo = número de colonias contadas / número de células sembradas
2 fracción Sobrevivir = (Número de colonias contadas / número de células sembradas) / eficiencia de plaqueo
Tabla 1. Cálculo de eficiencia de plaqueo y la supervivencia y la comparación de los recuentos de colonias utilizando diversos métodos de
Figura 1. Digital de imágenes que muestran colonias producidas por el hombre, FEP-1811, los queratinocitos siguientes placas de 1000 células y ocho días de incubación. (A) Las células fueron irradiados con 4 Gy y (B) las células fueron tratadas con 20 mg / ml de la ACB durante 1 hora a 37 ° C antes de la irradiación con 4 Gy. Un efecto de la radiación de protección con la formulación antioxidante natural es evidente.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
El apoyo del Instituto Australiano de Ciencia Nuclear e Ingeniería se reconoce. TCK es el ganador de premios AINSE. Laboratorio de Medicina epigenómico el apoyo de la Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia (566.559). HR es apoyado por un australiano de post-grado y premios BakerIDI brillante chispa. Este trabajo está financiado por el CRC de Imágenes Biomédicas Development Ltd (CRC-BID), creado y apoyado en cooperación del gobierno australiano de investigación del programa de Centros. CO es el receptor de un australiano de post-grado de premios y una beca complementaria CRC-BID.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon Instruments | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
