Klonogena analysen: Vidhäftande Cells

Summary

Tillämpligheten av klonogena test för utvärdering av reproduktiv lönsamheten har varit etablerad i mer än 50 år. Här kan vi visa det allmänna förfarandet för att utföra klonogena analys med tillhörande celler.

Abstract

Den klonogena (eller kolonibildande assay) har varit etablerad i mer än 50 år, de ursprungliga papper som beskriver tekniken publicerades 1956 ^1. Förutom att dokumentera metoden genererade första banbrytande studie den första strålning dosresponskurvan för röntgen bestrålade däggdjur (HeLa) celler i kultur ^1. I grund och botten gör det möjligt klonogena analysen en bedömning av skillnader i reproduktiv livskraft (förmåga celler att producera avkomma, det vill säga en enda cell att bilda en koloni med 50 eller flera celler) mellan kontroll obehandlade celler och som har genomgått olika behandlingar såsom exponering för joniserande strålning, olika kemiska föreningar (t ex cytostatika) eller i andra fall genmanipulation. Analysen har blivit den mest accepterade teknik i strålningsbiologi och har i stor utsträckning använts för att utvärdera strålningen känslighet för olika cellinjer. Vidare är klonogena analys som ofta används för att övervaka effekten av strålningen ändra föreningar och för att bedöma effekterna av cytostatika och andra anti-cancer läkemedel på kolonibildande förmåga, i olika cellinjer. En typisk klonogena överlevnad experiment med tillhörande cellinjer innefattar tre olika delar, 1) behandling av cellen cellslager i behållare vävnadsodling, 2) beredning av enskilda cellsuspensioner och plätering ett lämpligt antal celler i petriskålar och 3) fastställande och färgning kolonier efter en relevant inkubationstid, som kan variera från 1-3 veckor, beroende på vilken cellinje. Här kan vi visa det allmänna förfarandet för att utföra klonogena analysen med tillhörande cellinjer med hjälp av ett förevigat mänskliga keratinocyte cellinje (FEP-1811) ^2. Även vårt mål är att beskriva vanliga funktioner i klonogena analyser, bland annat beräkning av bordläggningen effektivitet och fraktioner överlevnad efter exponering av celler för strålning och att exemplifiera modifiering av strålning-respons med hjälp av en naturlig antioxidant formulering.

Protocol

1. Cellkultur och experimentell Set-up

1. Mänskliga keratinocyter hålls som monolager på 75 cm ² kolvar vävnadsodling som innehåller 15 ml keratinocyte-SFM (K-SFM) medium (GIBCO, serumfritt medium) kompletteras med L-glutamin (2 mm), epidermal tillväxtfaktor (5 ng / mL), nötkreatur hypofysen extrakt (40 mikrogram / ml) och 20 mg / ml gentamicin. Cellerna odlas i en fuktig 5% CO ₂ miljö vid 37 ° C.
2. Celler är seedade i 12 x 25 cm ² kolvar vävnadsodling som innehåller 5 ml av K-SFM medium.

Enstaka cellsuspensioner bereds av trypsinization. Cellerna tvättas med fosfatbuffrad saltlösning och inkuberas med en 0,05% trypsin / EDTA-lösning i 5-10 minuter. När cellerna börjar bli rund och ~ 30% är fristående, 3 volymer av Dulbecco ändrade örn medium som innehåller 10% fetalt bovint serum tillsätts neutralisera trypsin. Cellerna är loss genom att pipettera upp och ner (20 gånger). Celler räknas med hjälp av en hemocytometer.

Lämpliga cell nummer är seedad enligt den fördubbling tiden för cellinje (cirka 20 timmar för mänskliga FEP-1811 keratinocyter). Målet är att nå ~ 90% confluency (~ 10 ⁶ celler per flaska) på dagen för experimentet.

Ett experiment som består av 12 flaskor är optimal för en enda klonogena analys (sex obestrålat kontroll och sex bestrålade flaskor) som kan fyllas i cirka fyra timmar.

2. Behandling och bestrålning

1. Behandla celler för en lämplig tid med en relevant strålning ändra förening och utsätta celler för joniserande strålning antingen γ-strålning eller röntgenstrålning.

Normalt sex kolvar fungera som plätering effektivitet (obehandlat) och drog bara kontroller. De övriga sex flaskor bestrålas.

I detta exempel mänskliga keratinocyter behandlas med olika koncentration av Cinnulin PF (CPF, Integrity nutraceuticals International, Spring Hill, TN, USA, representativa data för 20 mikrogram / ml visas nedan), en vattenlöslig naturlig antioxidant formulering, för 1 timme vid 37 ° C. Celler är bestrålas med 4 Gy med hjälp av en ¹³⁷ Cs källa (Gammacell 1000 Elit irradiator, Nordion International, ON, Kanada, 1,6 Gy / min).

3. Plating

1. Efter behandling, är ensamstående cellsuspensioner erhålls som beskrivits tidigare.
2. Antalet celler i varje prov räknas försiktigt med en hemocytometer och efter utspädning så att lämpliga cell nummer är seedade i petriskålar (fem replikat av vardera 15 mm rätter).
   Den plätering effektivitet och / eller efterlevande bråkdel bör förutses när beslut fattas av antalet celler till utsäde per platta. Målet är att uppnå en räckvidd på mellan 20 - 150 kolonier.

Petriskålar är ordnade i en fuktig plast kloning rutan och inkuberas i en 5% CO ₂ miljö vid 37 ° C i koloni bildas.

Inkubationstiden för koloni bildning varierar från 1-3 veckor för olika cellinjer, det är accepterat att tiden ska motsvara minst sex celldelningar. I detta exempel kontroll rätter för mänskliga keratinocyter kräver åtta dagar för att bilda tillräckligt stora kloner som består av 50 eller flera celler.

4. Fastställande och färgning Kolonierna

Utför följande steg i dragskåp.

1. Ta försiktigt bort media från alla plattorna genom aspiration.
2. Tvätta varje platta med 5 ml 0,9% koksaltlösning.
3. Fäst kolonier med 5 ml 10% buffrad neutral formalin lösning i 15-30 minuter.
4. Fläcken med 5 ml 0,01% (w / v) kristallviolett i dH ₂ O i 30-60 minuter.
5. Tvätta överskott kristallviolett med dH ₂ O och låt disken torka.

5. Colony Räkna

Stereomikroskop

1. Kolonier som innehåller mer än 50 enskilda celler räknas med hjälp av ett stereomikroskop.

Digital bildbehandling och räkna med bildbehandlingsprogram

1. Digitala bilder av kolonierna erhålls med hjälp av en kamera eller scanner
2. Kolonierna räknas med hjälp av bildbehandling paket analys programvara som beskrivs nedan.

Cell räkna med ImageJ (Fiji version 1.44a)

1. Öppna bildfilen i Fiji, gå till Arkiv -> Öppna.
2. Vid behov konvertera bilden till 8-bitars format, gå till Image -> Adjust ...-> Tröskelvärde.
3. Justera tröskelvärdet för att minska nivåerna av icke-specifika bakgrunden så att bara kolonierna upptäcks.
4. Räkna kolonier med följande: Gå till Process -> Binär -> Hitta maxima.

För detta bildformat, kan buller tolerans sättas till 0. Se till att ljus bakgrund alternativet är markerat ochförhandsgranska de upptäckta maxima att kontrollera att alla celler kolonier riktigt har registrerats.

Discussion

I detta exempel mänskliga FEP-1811 keratinocyter behandlades med olika koncentrationer upp till 100 mikrogram / ml CPF, data visas för 20 mikrogram / ml CPF i 1 timme vid 37 ° C. Efter behandling celler bestrålas med 4 Gy med hjälp av en ¹³⁷ Cs källa (Gammacell 1000 Elit irradiator, Nordion International, ON, Kanada, 1,6 Gy / min). För kontroll obehandlade och drog bara behandlingar 100 celler var klädd i varje petriskål och 1000 celler per fat var klädd för bestrålade prover. Som framgår av tabellen ovan var kolonierna räknades med hjälp av ett stereomikroskop eller digitala bilder (Fig 1) tas för att räkna med ImageJ. Det genomsnittliga antalet mikroorganismer för de fem maträtter användes för att beräkna plätering effektivitet och överlevande fraktion. De data som visade en strålning skyddande effekt (skyddsfaktor ~ 3) med den naturliga antioxidanten formulering.

Representativa resultat

Behandling	Räkna Metod	Cell pläterade	1	2	3	4	5	Plating Efficiency1	Överlevande Fraction2
Obehandlade celler	Manuell (Stereomikroskop)	100	19	22	38	14	20	0,23	1
	Manuell (Digital bild)	100	22	23	34	15	22	0,23	1
	Hitta Maxima (Fiji)	100	23	21	33	14	21	0,22	1
20 mM CPF	Manuell (Stereomikroskop)	100	18	11	21	15	11	0,15	0,66
	Manuell (Digital bild)	100	19	11	23	16	8	0,15	0,67
	Hitta Maxima (Fiji)	100	17	11	22	17	8	0,15	0,65
4 Gy	Manuell (Stereomikroskop)	1000	39	27	28	44	28	0,03	0,14
	Manuell (Digital bild)	1000	42	33	31	42	31	0,04	0,16
	Hitta Maxima (Fiji)	1000	42	35	30	43	31	0,04	0,16
20 mM CPF + 4 Gy	Manuell (Stereomikroskop)	1000	115	105	98	108	101	0,11	0,47
	Manuell (Digital bild)	1000	117	102	104	103	99	0,11	0,45
	Hitta Maxima (Fiji)	1000	121	102	104	102	97	0,11	0,47

¹ Plating effektivitet = antal kolonier räknade / antal pläterade celler
² Surviving fraktion = (antal kolonier räknade / antal celler pläterade) / beläggning effektivitet

Tabell 1. Beräkning av bordläggning effektivitet och överlevnad och jämförelse av kolonier med hjälp av olika metoder

Figur 1. Digital bild som visar kolonier produceras av mänskliga, FEP-1811, keratinocyter efter plätering av 1000 celler och åtta dagars inkubation. (A) Celler bestrålas med 4 Gy och (B) celler behandlades med 20 mikrogram / ml CPF i 1 timme vid 37 ° C före bestrålning med 4 Gy. En strålning skyddande effekt med naturlig antioxidant formuleringen är uppenbar.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Keratinocyte-serum free medium	Growth medium	Invitrogen	17005042	Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract.
Trypsin-EDTA		Invitrogen	15400-054	0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+.
Dulbecco’s modified essential medium	Growth medium	Invitrogen	11885-084	Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA.
0.09% Saline	Solution			Used to wash colonies.
10% Neutral buffered formalin solution	Solution	Sigma-Aldrich	HT501128	~4% formaldehyde; used to fix colonies.
Crystal violet	Powder	SPI Supplies	02577-MB	0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies.
Gammacell 1000 elite irradiator		Nordion International Inc.
Petri dishes	60 x 15 mm	Falcon BD	353002
Haemocytometer		Hawksley; Medical and Laboratory Equipment	AC1000
Cloning box				Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation.
Stereomicroscope	Type 102	Nikon Instruments		Used to count colonies consisting of >50 cells.