Summary
50 yıldan fazla üreme canlılığını değerlendirmek için clonogenic testin uygulanabilirliği için kurulmuştur. Burada yapışık hücrelere clonogenic tahlil yapmak için genel prosedür göstermektedir.
Abstract
Clonogenic (ya da koloni oluşturan) testinin, 50 yılı aşkın kurulmuştur; 1956 1 tekniğini anlatan orijinal kağıt yayımlandı. Yöntemini belgeleyen dışında, ilk dönüm noktası çalışma kültürü 1 X-ray ışınlanmış memeli (HeLa) hücreleri için ilk radyasyon doz yanıt eğrisi oluşturulur. Kontrolü tedavi edilmezse hücreleri ve bu tür maruz kalma gibi değişik işlemlerden geçirilmiş hücreleri arasında; Temelde, clonogenic testi üreme canlılığı farklılıkları (50 veya daha fazla hücre bir koloni oluşturmak için tek bir hücre yani döl hücreleri kapasitesi) bir değerlendirme sağlar radyasyon iyonize, çeşitli kimyasal bileşikler (örneğin sitotoksik ilaçlar) ya da diğer durumlarda genetik manipülasyon. Tahlil radyasyon biyolojisi en yaygın kabul gören bir tekniği haline gelmiştir ve farklı hücre hatları radyasyon duyarlılığı değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır olmuştur. Ayrıca, clonogenic testi yaygın radyasyon değiştirerek bileşiklerin etkinliğinin izlenmesi ve koloni oluşturan farklı hücre hatları yeteneği, sitotoksik ajanlar ve diğer anti-kanser tedavileri etkileri belirlemek için kullanılır. Yapışık hücrelere hatları ile tipik bir clonogenic hayatta kalma deney koloniler tespit ve boyama üç farklı bileşenleri, 1), doku kültürü şişeler, hücre monolayer tedavisi, 2) tek bir hücre süspansiyonlarının hazırlanması ve uygun bir hücre sayısı petri kaplarına ve 3 kaplama) içerir. ilgili bir kuluçka dönemi sonrası, hangi hücre hattı bağlı olarak, 1-3 hafta arasında olabilir. İşte biz, bir ölümsüzleştirdi insan keratinosit hücre hattı kullanımı (FEP-1811) 2 ile yapışık hücre hatları ile clonogenic tahlil yapmak için genel prosedürü göstermektedir . Ayrıca, bizim hedeflerimize hücreleri radyasyona maruz kaldıktan sonra kaplama verimliliği ve hayatta kalma fraksiyonları hesaplama da dahil olmak üzere clonogenic testlerinin ortak özelliklerini tanımlamak ve doğal bir antioksidan formülasyonu kullanımı ile radyasyon cevap modifikasyonu örneklemek için.
Protocol
1. Hücre Kültürü ve Deneysel Set-up
- İnsan keratinositler keratinosit-SFM 15 mL (K-SFM) içeren 75 cm 2 doku kültürü şişeleri mono tabakaları olarak korunur, L-glutamin (2 mM), epidermal büyüme faktörü (5 ng ile desteklenmiş orta (Gibco, serum serbest orta ) / ml), sığır hipofiz ekstresi (40 mg / ml) ve 20 mg / ml gentamisin. Hücreler 37 ° C nemlendirilmiş bir% 5 CO 2 ortamında yetiştirilen
- Hücreler, 5 ml K-SFM orta içeren 12 x 25 cm 2 doku kültürü şişeler içine numaralı seribaşı .
Tek hücre süspansiyonları trypsinization tarafından hazırlanır. Hücreler, fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkanır ve 5-10 dakika için% 0.05 tripsin / EDTA çözeltisi ile inkübe edilir. Hücreler haline başladığınızda yuvarlak ve müstakil ~% 30,% 10 fetal sığır serumu içeren Dulbecco'nun modifiye kartal orta 3 cilt tripsin nötralize etmek için eklenir. Hücreleri (20 kez) yukarı ve aşağı pipetleme ayrılır. Hücreler hemasitometre kullanarak sayılır.
Uygun hücre sayıları iki katına zaman hücre hattı (insan FEP-1811 keratinositler için yaklaşık 20 saat) göre seribaşı. Amacı, deney günü ~% 90 confluency (şişesi ortalama ~ 10 6 hücre) elde etmektir .
12 şişe oluşan bir deney yaklaşık dört saat içinde tamamlanmalıdır tek bir clonogenic assay (altı ışınlanmamış kontrolü ve altı ışınlanmış şişeler) için en uygunudur.
2. Tedavi ve ışınlama
- Ilgili bir radyasyon değiştirerek bileşik uygun bir zaman için hücreleri tedavi ve hücreleri iyonize radyasyon γ-radyasyon veya X-ışınları ya maruz.
Genellikle altı şişeler, kaplama verimlilik (işlenmemiş) ve ilaç denetimlerin sadece olarak hizmet vermektedir. Diğer altı şişeler ışınlanmış.
1 saat suda eriyen bir doğal antioksidan formülasyonu, bu örnekte insan keratinositler Cinnulin PF çeşitli konsantrasyonlarda (20 mg / ml aşağıda gösterilmiştir temsilcisi veri; Dürüstlük Nutraceuticals Uluslararası, Spring Hill, TN, ABD CPF) ile tedavi edilir 37 ° C Hücreler 137 Cs kaynak (Nordion Uluslararası, ON, Kanada; 1.6 Gy / dk Gammacell 1000 Elite ışınlama) kullanılarak 4 Gy ışınlanmış.
3. Kaplama
- Daha önce açıklandığı gibi, tedavisi sonrasında, tek hücre süspansiyonları elde edilir.
- Her bir numune hücrelerinin sayısını dikkatli bir şekilde hemasitometre kullanarak, uygun hücre sayıları (beş 15 mm yemekleri her çoğaltır) petri kutularının içine numaralı seribaşı sayılır ve seyreltilir.
Plaka başına tohum hücrelerinin sayısını karar verirken kaplama verimliliği ve / veya fraksiyon hayatta tahmin edilmelidir. 150 koloniler - 20 arasında bir dizi amacı gerçekleştirmek için.
Petri kutularına nemlendirilmiş bir plastik klonlama kutusu olarak düzenlenmiş ve koloni oluşumu için 37 ° C,% 5 CO 2 ortamında inkübe .
Koloni oluşumu için inkübasyon süresi 1-3 hafta farklı hücre hatları için değişir, o zaman en az altı hücre bölünmeleri eşdeğer olması gerektiğini kabul edilir. Bu örnekte, insan keratinositler için kontrol yemekleri sekiz gün, 50 ya da daha fazla hücreden oluşan yeterince büyük klonlar formu gerektirir.
4. Tespit ve Boyama Kolonileri
Davlumbaz aşağıdaki adımları tamamlayın.
- Aspirasyon ile hafifçe plakaların her medya çıkarın.
- Her plaka 5 ml% 0.9 'luk tuzlu su ile yıkayın.
- 15-30 dakika için 5 ml% 10'luk nötral tamponlu formalin ile koloniler sabitleyin.
- 30-60 dakika dH 2 O 5 ml% 0,01 (w / v) kristal viyole ile Leke.
- DH 2 O ile aşırı kristal viyole yıkayın ve yemekleri kurumasını bekleyin.
5. Koloni Sayım
Stereomikroskopta
- 50 den fazla bireysel hücre içeren Kolonileri stereomikroskopta kullanarak sayılır.
Dijital görüntüleme ve görüntüleme yazılımı kullanarak sayma
- Kolonilerin Dijital görüntüler bir kamera kullanarak ya da cihaz tarama elde edilir
- Kolonileri aşağıda açıklandığı gibi görüntü analiz yazılımı paketleri kullanarak sayılır.
ImageJ (Fiji Sürüm 1.44a) kullanarak hücre sayımı
- Fiji görüntü dosyasını açın, Dosya -> Aç.
- > Ayarlayın ...-> Eşik görüntü 8-bit formatına dönüştürebilirsiniz Gerekirse, Görüntü gitmek.
- Böylece sadece koloniler tespit non-spesifik arka plan seviyesini düşürmek için eşik ayarlayın.
- Aşağıdaki kullanarak kolonilerin sayısı: Proses -> Binary -> maxima bul.
Bu görüntü formatı için, gürültü toleransı 0 olarak ayarlanır. O ışık arka plan seçeneği işaretli olduğundan emin olun vetespit maxima önizleme tüm hücre kolonileri doğru kayıtlı olup olmadığını kontrol edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu örnekte, 100 mcg / ml CPF insan FEP-1811 keratinositler çeşitli konsantrasyonlarda ile tedavi edildi; veriler 37 1 saat için 20 mg / ml CPF ° C için gösterilen Ardından tedavi hücreleri 137 Cs kaynak (Nordion Uluslararası, ON, Kanada; 1.6 Gy / dk Gammacell 1000 Elite ışınlama) kullanılarak 4 Gy ışınlanmış. Tedavi edilmemiş ve ilaç tedavileri 100 hücre kontrolü için her bir petri kaplama ve çanak başına 1000 hücreleri ışınlanmış örnekler için kaplanmıştır. Yukarıdaki tabloda belirtildiği gibi, koloniler stereomikroskopta veya dijital görüntü (Şekil 1) kullanılarak sayıldı ImageJ kullanarak sayma alındı. Beş yemekleri için ortalama koloni sayısı kaplama verimlilik ve hayatta kalan fraksiyonu hesaplamak için kullanılmıştır. Veri doğal antioksidan formülü ile bir radyasyon koruyucu etkisi (koruma faktörü ~ 3) gösterdi.
Temsilcisi Sonuçlar
| Tedavi | Yöntemi Sayma | Kaplama Hücre | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Kaplama Efficiency1 | Kalan Fraction2 |
| Tedavi edilmeyen Hücreler | Manuel (Stereomikroskopta) | 100 | 19 | 22 | 38 | 14 | 20 | 0,23 | 1 |
| Manuel (Dijital görüntü) | 100 | 22 | 23 | 34 | 15 | 22 | 0,23 | 1 | |
| Maxima bul (Fiji) | 100 | 23 | 21 | 33 | 14 | 21 | 0,22 | 1 | |
| 20 mM CPF | Manuel (Stereomikroskopta) | 100 | 18 | 11 | 21 | 15 | 11 | 0,15 | 0,66 |
| Manuel (Dijital görüntü) | 100 | 19 | 11 | 23 | 16 | 8 | 0,15 | 0,67 | |
| Maxima bul (Fiji) | 100 | 17 | 11 | 22 | 17 | 8 | 0,15 | 0,65 | |
| 4 Gy | Manuel (Stereomikroskopta) | 1000 | 39 | 27 | 28 | 44 | 28 | 0,03 | 0,14 |
| Manuel (Dijital görüntü) | 1000 | 42 | 33 | 31 | 42 | 31 | 0,04 | 0,16 | |
| Maxima bul (Fiji) | 1000 | 42 | 35 | 30 | 43 | 31 | 0,04 | 0,16 | |
| 20 mM CPF + 4 Gy | Manuel (Stereomikroskopta) | 1000 | 115 | 105 | 98 | 108 | 101 | 0,11 | 0,47 |
| Manuel (Dijital görüntü) | 1000 | 117 | 102 | 104 | 103 | 99 | 0,11 | 0,45 | |
| Maxima bul (Fiji) | 1000 | 121 | 102 | 104 | 102 | 97 | 0,11 | 0,47 |
1 Kaplama verimliliği = kolonilerin sayısı / kaplama hücrelerinin sayısı sayılır
2 Surviving fraksiyonu = (kaplama hücrelerinin / sayısı kolonilerin sayısı) / kaplama verimliliği
Tablo 1: kaplama verimlilik ve hayatta kalma ve çeşitli yöntemler kullanarak koloni sayımı karşılaştırılması Hesaplama
Şekil 1 insan, FEP-1811, 1000 hücreleri kaplama ve sekiz gün kuluçka aşağıdaki keratinositler tarafından üretilen koloniler gösteren Dijital görüntü. (A) Hücreler 4 Gy ışınlanmış ve (B) hücreleri 37 ° C 4 Gy ışınlama önce 1 saat boyunca 20 mg / ml CPF ile tedavi edildi. Doğal antioksidan formülü ile radyasyon koruyucu etkisi açıktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Avustralya Nükleer Bilimi ve Mühendisliği Enstitüsü destek kabul edilmektedir. TCK AINSE ödül layık görüldü. Epigenomic Tıp Laboratuarı, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (566.559) Avustralya tarafından desteklenmektedir. İK, Avustralya, mezuniyet sonrası ve BakerIDI parlak kıvılcım ödül tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, Biyomedikal Görüntüleme Geliştirme Ltd (CRC-BID), kurulan ve Avustralya Hükümeti Ortak Araştırma Merkezleri programı kapsamında desteklenen CRC tarafından finanse edilmektedir. CO Avustralyalı bir mezuniyet sonrası ödül ve CRC-BID ek burs almıştır.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon Instruments | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
