Summary
يصف هذا بروتوكول طريقة لقياس الوقت الحقيقي لتدفقات الكالسيوم الميتوكوندريا بواسطة التصوير الفلورسنت. الأسلوب يستفيد من permutated دائري YFP المستندة إلى الاستشعار الكالسيوم ثنائي الإثارة ratiometric (ratiometric pericam - طن متري) : أعرب عن انتقائية في الميتوكوندريا.
Abstract
التغيرات الدينامية في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا استجابة لمختلف المحفزات ينظم العديد من العمليات الخلوية مثل انتشار الأسلحة النووية ، والتمايز ، وموت الخلايا المبرمج 1. موت الخلايا المبرمج خلال تراكم الكالسيوم في الميتوكوندريا يعزز الافراج عن أفكارك العوامل المؤيدة للمن الميتوكوندريا في العصارة الخلوية 2. لذلك فإنه من مصلحة مباشرة لقياس الكالسيوم الميتوكوندريا في الخلايا الحية في الموقع خلال موت الخلايا المبرمج. وقد ثبت عالية الدقة التصوير الفلورية لخلايا محملة المزدوجة وعدم إثارة ratiometric ratiometric الأصباغ الاصطناعية مؤشر الكالسيوم ليكون أداة موثوقة ومرنة لدراسة مختلف جوانب إشارات الكالسيوم داخل الخلايا. قياس تدفقات الكالسيوم عصاري خلوي استخدام هذه التقنيات واضحة نسبيا. ومع ذلك ، وقياس مستويات الكالسيوم في الخلايا intramitochondrial سليمة باستخدام مؤشرات مثل الكالسيوم الاصطناعية rhod - 2 و FF - rhod هو أكثر تحديا. لقد أضعفت المؤشرات الاصطناعية التي تستهدف الميتوكوندريا الردود على الزيادات المتكررة في الكالسيوم الميتوكوندريا ، وتعطيل مورفولوجيا الميتوكوندريا 3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المؤشرات تميل إلى تسرب الاصطناعية من أصل أكثر من الميتوكوندريا عدة ساعات مما يجعلها غير صالحة للتجارب طويلة الأمد. وبالتالي ، فقد سهلت المؤشرات الكالسيوم المرمزة وراثيا على أساس الفلورية الخضراء 4 (GFP) أو البروتين aequorin 5 الميتوكوندريا التي تستهدف بشكل كبير قياس الكالسيوم ديناميات الميتوكوندريا. هنا ، نحن تصف طريقة بسيطة لقياس الوقت الحقيقي لتدفقات الكالسيوم الميتوكوندريا استجابة لمحفزات مختلفة. يستند هذا الأسلوب على المجهري مضان من 'pericam - ratiometric" التي تستهدف بشكل انتقائي للالميتوكوندريا. pericam Ratiometric الكالسيوم هو مؤشر على أساس مزيج من بروتين فلوري permuted دائري الصفراء وكالمودولين 4. من الكالسيوم لملزم pericam ratiometric أسباب تحول في ذروة الإثارة والخمسين من 415 نانومتر إلى 494 نانومتر ، في حين أن الطيف الانبعاثات ، والتي تصل ذروتها حوالي 515 نانومتر ، لا تزال دون تغيير. Ratiometric pericam يربط أيون الكالسيوم واحد مع التفكك المستمر في المختبر من 1.7 ميكرومتر ~ 4. هذه الخصائص تسمح للpericam ratiometric القياس الكمي للتغيرات السريعة والطويلة الأجل في تركيز الكالسيوم الميتوكوندريا. وعلاوة على ذلك ، ونحن تصف تكييف هذه المنهجية في مستوى الكالسيوم واسعة حقل التصوير المجهر مع مجموعات التصفية المتاحة عموما. باستخدام اثنين من منبهات متميزة ، وpurinergic ATP ناهض وموت الخلايا المبرمج الذي يحفز staurosporine المخدرات ، وعلينا أن نظهر أن هذا الأسلوب مناسب لرصد التغيرات في تركيز الكالسيوم الميتوكوندريا مع القرار الزماني للثانية لساعات. وعلاوة على ذلك ، ونحن أيضا أن تثبت أن pericam ratiometric مفيد أيضا لقياس الانشطار الميتوكوندريا / التجزئة خلال موت الخلايا المبرمج. وبالتالي ، هو مناسبة بشكل خاص لقياس pericam ratiometric على المدى الطويل المستمر من خلال ديناميات الكالسيوم الميتوكوندريا موت الخلايا المبرمج.
Protocol
1. Pericam - ترنسفكأيشن طن متري ، وإعداد الخلية.
- لوحة خلايا هيلا الليلة قبل ترنسفكأيشن coverslips على زجاج معقمة توضع في طبق معيار ثقافة 6 - جيدا.
- إعداد DNA / 2000 Lipofectamine المجمعات كما اقترح من قبل الشركة المصنعة (Invitrogen). نحن نستخدم 4 ميكروغرام من ناقلات التعبير ratiometric - pericam - طن متري و 10 ميكرولتر من عام 2000 Lipofectamine مخففة في 0.5 مل من OPTI - MEM لكل بئر. وينبغي أن تكون الخلايا ~ متموجة 70 ٪ قبل ترنسفكأيشن.
- هيلا استبدال ثقافة الإعلام (Dulbecco لتعديل النسور المتوسطة ، و 10 ٪ FBS ، البنسلين / الستربتوميسين) في كل بئر مع 1.5 مل من وسائل الإعلام نفسها من دون مضادات حيوية.
- إضافة المجمعات الحمض النووي / Lipofectamine إلى أن كل بئر transfected. المزيج بلطف مع هزاز واحتضان لمدة 4 ساعات في زنزانة حاضنة الثقافة في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2.
- استبدال المضادات الحيوية خالية من وسائل الاعلام مع وسائل الاعلام الثقافة مع المضادات الحيوية. السماح للتعبير عن خلايا pericam ratiometric لمدة 1-2 أيام قبل التصوير.
2. إعداد المجهر والحصول على الصور
- مكان ساترة مع خلايا هيلا الى غرفة التصوير المناسبة مع حلول التصوير : 107mM كلوريد الصوديوم ، بوكل 7.2mM ، 1.2mM MgCl 2 ، 1MM CaCl 2 ، 11.5mM الجلوكوز ، 0.1 ٪ ألبومين المصل البقري ، وHEPES 20mM 7.2. مختبرنا يستخدم غرفة خلية Attofluor من Invitrogen. جبل غرفة التصوير في مرحلة مجهر مقلوب.
- العثور على مجال اهتمام تحتوي على واحد أو أكثر من الخلايا معربا عن pericam ratiometric باستخدام الغمر 40X النفط (أو أعلى) الهدف. لقد وجدنا أن pericam ratiometric أقل مقاومة للphotobleaching في 380 نانومتر ، وبالتالي فإننا نستخدم هذا الطول الموجي لتحديد الخلايا المناسبة. للصور تم الحصول عليها في الشكل 1 ، كان يستخدم هدفا Superfluor نيكون 40X مع فتحة 1.3 العددية. والأهداف أعلى التكبير يكون من المناسب أيضا (100X 60). والفلاتر المستخدمة الإثارة شروما تكنولوجيا المرشحات D380/30x (380 + / -- 30 نانومتر) ، وD495/10 (495 + / -- 5 نانومتر) ، وكان beamsplitter 505DCXR (505nm longpass) ، وكان انبعاث تصفية HQ535/50m (535 + / -- 25nm).
مجهر لدينا تستخدم للحصول على صور في الشكل (1) يتكون من TE2000 نيكون المجهر المقلوب مجهزة العلمية روبر Coolsnap HQ تبريد CCD الكاميرا ، Ludl MAC6000 عجلة التصفية السريعة والمغير ، والحصول على البيانات والبرمجيات MetaFluor التحليل. ويمكن تكييف هذا البروتوكول إلى أي مجال واسع المجهر القياسية مع الفلاتر المناسبة والبرامج قادرة على التقاط ومعالجة الصور ratiometric. - إعداد برامج لاستثارة المزدوجة باستخدام مرشحات 495 و 380 نانومتر. الكالسيوم ملزمة لpericam ratiometric الزيادات الامتصاصية في 495 نانومتر ، وبالتالي يجب أن ضبط نسبة تصل إلى 495 nm/380 نانومتر.
Ratiometric pericam ديه الكالسيوم الخالية من الإثارة ذروتها في 415 نانومتر 4. في هذا البروتوكول نقترح باستخدام 380 نانومتر فقط لأنه مرشح في كل مكان في معظم المختبرات التصوير الكالسيوم. إذا كان تصفية 410 نانومتر متوفرا ، فمن الأفضل لتصفية نانومتر 380. - الحصول على صور مثيرة من قبل بالتسلسل بدلا من 495 و 380 في نانومتر. الحصول على صور من مستويات الكالسيوم في الأساس على الأقل 30 ثانية قبل تطبيق ناهض عبر جهاز نضح. علامة الوقت بالإضافة لكل ناهض. وينبغي أن يكون الأمثل مرات وفترات التعرض للحيلولة دون حيازة photobleaching حين لا يزال يسمح كافية المثال resolution.For الزمنية ، لديناميات الكالسيوم شبه السريع رصد استجابة لتحفيز ناهض ، استحوذت صور كل ثانيتين في 1B أرقام ومعدلات اقتناء جيم أسرع بكثير من الممكن أيضا 6. وكانت الشركة على المدى الطويل بعد التصوير مع الادارة staurosporine أطول الفاصل الزمني (30S) بين الاستحواذ (الشكلان 1 D و E).
3. معالجة الصور وتحليل
- بمجرد اكتمال التجربة ، يمكن تحليل الصور التي تم الحصول عليها حاليا. تحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) الذي تريد لرصد التغيرات في مستويات الكالسيوم. استخدام ROI مختارة داخل منطقة فارغة من الحقل إلى طرح الخلفية إذا لزم الأمر. وتجدر الإشارة إلى أن الميتوكوندريا هي متحركة وديناميكية للغاية ، واستقراء الأحداث في الحبيبات الخيطية واحد على مدى فترات طويلة ليست دائما ممكنة. وبالتالي ، نظرا لحركية عالية من هذه العضية في بعض أنواع الخلايا ، ينبغي اختيار ROI يتم رصدها بعناية. وعلاوة على ذلك ، كما يتضح في الشكل 1 ، والاستجابة للمؤثرات الميتوكوندريا heterogeneously المختلفة. ولذلك فمن المهم لتحليل البيانات ورصد حاليا RO1 التنسيب على أساس الإطار حسب الإطار. وقد وصفت وصفا مفصلا لقياس الكالسيوم في الميتوكوندريا الميتوكوندريا متحركة للغاية في مكان آخر 7.
- يمكن استيراد نسبة القياسات التي تم الحصول عليها من عائد الاستثمار في Excel أو graphingsoftware مماثلة. ويمكن عرض البيانات كما يمثل تتبع التغيرات في مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا في خلية واحدة أو الحبيبات الخيطية واحد ، أو متوسط فلوريداuorescence إشارات من ROI عدة. وقد استخدمنا هذه التقنية أيضا لقياس متوسط مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا السكان من الخلايا الليمفاوية تمر موت الخلايا المبرمج الناجمة عن يجند فاس 8.
4. ممثل النتائج :
الشكل 1. (أ) من توطين التحت خلوية ratiometric - pericam - طن متري. هذه الصورة الأولى يظهر الخلية الحية هيلا معربا عن ratiometric - pericam - طن متري. في الصورة الثانية يظهر تلطيخ الفلورسنت مع الحبيبات الخيطية انتقائية صبغ MitoTracker CMXRos الأحمر. ومضان الصفراء في الصورة المدمجة يوضح شارك في توطين ratiometric - pericam - طنا ومضان MitoTracker (B) سلسلة من نسبة pseudocolor (495:380 نانومتر) صورا لخلايا هيلا معربا عن 4 طن متري ، ratiometric pericam تعامل مع ATP 10 مم (C) إلى القياس الكمي للتغيرات في مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في (ب) سلسلة (D) تعامل مع ATP 10 مم. نسبة pseudocolor (495:380 نانومتر) صورا للتعبير عن خلية هيلا طن متري - ratiometric pericam تعامل مع staurosporine ميكرومتر 0.5. الاختلاف في الاستجابة الكالسيوم في الميتوكوندريا الفرد هو واضح ، وكذلك تجزئة كبيرة من الميتوكوندريا بنسبة 60 دقيقة. بعض الميتوكوندريا زيادات متذبذبة في الكالسيوم (أبيض الرأس السهم) ، في حين أن البعض الآخر لا تظهر تغيرات كبيرة في مستوى الكالسيوم (أصفر رئيس السهم) (E) الكمي للزيادات في مستويات الكالسيوم العالمية الميتوكوندريا في زنزانة واحدة بعد هيلا استحثاث موت الخلايا المبرمج مع 0.5 ميكرومتر staurosporine.
Discussion
نقدم هنا طريقة بسيطة جدا لقياس الكالسيوم الميتوكوندريا الميتوكوندريا باستخدام استهداف pericam ratiometric. كما هو مبين في الشكل 1A ، وذلك باستخدام معيار widefield البصريات مع عدم وجود deconvolution أنه من الممكن بسهولة عرض الميتوكوندريا الفردية في خلايا هيلا مع نسبة الإشارة إلى الضجيج مقبول. وذلك لأن خلايا هيلا ، مثل معظم الخلايا في الثقافة ، وتتسطح الى حد كبير عندما ملتصق تفادي الحاجة للفحص المجهري مبائر أو المعدات المتخصصة الأخرى. لقد تم العثور على نتائج مماثلة في الخلايا Jurkat التمسك بولي يسين coverslips المغلفة 8. على النقيض من منهجيات تستخدم الأصباغ ، فمن الممكن أيضا غير جراحية رصد مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا لساعات باستخدام مؤشرات الكالسيوم المرمزة وراثيا مثل pericam ratiometric (الشكل 1E). هذا مهم خصوصا عند تحليل الكالسيوم خلال الميتوكوندريا موت الخلية. وعلاوة على ذلك ، فمن الممكن أيضا تصور الانشطار / تجزئة الميتوكوندريا أثناء عملية أفكارك. كما هو مبين في 1D الأرقام والبريد ، ومعالجة الأسباب staurosporine زيادة بطيئة في الكالسيوم في مجموعات سكانية فرعية مختارة من القمم التي الميتوكوندريا في 20 دقيقة. مستويات الكالسيوم تنخفض مرة أخرى مع ما يصاحب ذلك التشرذم الميتوكوندريا قبل الصعود مرة أخرى 2 ساعة بعد تلقي العلاج. وهذا يتفق مع موجات بطيئة في عصاري خلوي الكالسيوم الناجم عن العلاج staurosporine قياسها باستخدام Fura - 2 9. وبالتالي ، يمكن الحصول على معلومات الحركية الهامة التي لا يمكن لأساليب توظيف قياسات ثابتة. على الرغم من أننا قد قدمت نسب تركيزات الكالسيوم وليس في الشكل (1) ، فمن الممكن لمعايرة أجهزة الاستشعار في الموقع لحساب مستويات الكالسيوم المطلق 4 و 10. توضيح هام واحد للنظر هو أن pericam ratiometric حساسة لدرجة الحموضة 4 و 10. لأن كلا من مستويات الحموضة عصاري خلوي والميتوكوندريا يمكن أن تتغير بشكل كبير خلال 11 موت الخلايا المبرمج ، وهذا هو أحد الاعتبارات الهامة. معايرة درجة الحموضة في pericam الميتوكوندريا المعزولة معربا عن إثبات أن زيادة [H +] زيادة انبعاث pericam عندما متحمس في 495 نانومتر ، مع تأثير ضئيل على الانبعاث المستحث بواسطة الإثارة عند 410 نانومتر ، وهي الخاصية التي تم استغلالها في وقت واحد لقياس كل من الكالسيوم والميتوكوندريا الحموضة 12. وهكذا ، ورصد الانبعاثات بشكل انتقائي مع الإثارة 410 نانومتر يوفر وسيلة لرصد الكالسيوم غير ratiometrically الميتوكوندريا مع القلق انخفاض لدرجة الحموضة. أخيرا ، وبروتوكول المعروضة هنا لا يتطلب سوى الحصول على مجهر epifluorescent القياسية مع المرشحات على نطاق واسع ، مما يجعل هذه التقنية في متناول معظم المختبرات.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر اتسوشي Miyawaki لتزويدنا بناء التعبير ratiometric - pericam - طن متري. وأيد هذا العمل عن طريق منح GM081685 من المعاهد الوطنية للصحة (DB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon Instruments | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. |
| Imaging Software | Molecular Devices | Metafluor | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Hajnoczky, G. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Miyawaki, A. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Shimozono, S. Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein. Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).
- Wozniak, A. L. Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).
- Boehning, D. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).
- Csordas, G. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
