Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מנצלת את חיישן YFP מבוססי permutated מעגלית סידן עירור כפול ratiometric (ratiometric pericam-MT) הביע סלקטיבי במיטוכונדריה.
Abstract
שינויים דינאמיים בריכוז סידן תוך תאי בתגובה לגירויים שונים מווסת תהליכים תאיים רבים, כגון ריבוי, התמיינות, אפופטוזיס ו 1. במהלך הצטברות סידן, אפופטוזיס במיטוכונדריה מקדמת את שחרורו של תומכי אפופטוטיים גורמים מן המיטוכונדריה לתוך 2 cytosol. לכן זה עניין למדוד ישירות סידן המיטוכונדריה בתאים חיים באתרו במהלך אפופטוזיס. ברזולוציה גבוהה דימות פלואורסצנטי של תאים עמוסה עירור כפול ratiometric ולא ratiometric צבעים אינדיקטור סינתטי סידן הוכח להיות כלי אמין צדדי ללמוד היבטים שונים של סידן איתות תאיים. מדידת והנתיבים סידן cytosolic באמצעות טכניקות אלה היא פשוטה יחסית. עם זאת, מדידת רמות סידן intramitochondrial בתאים שלמים באינדיקטורים סידן סינטטי כגון rhod-2 ו-FF rhod הוא יותר מאתגר. האינדיקטורים סינתטי ממוקד המיטוכונדריה הקהו התגובות מגביר חוזרות בסידן המיטוכונדריה, ולשבש מורפולוגיה המיטוכונדריה 3. בנוסף, האינדיקטורים סינתטיים נוטים לדלוף החוצה של המיטוכונדריה על כמה שעות מה שהופך אותם מתאימים לטווח ארוך ניסויים. לכן, האינדיקטורים סידן מקודדים גנטית מבוססת על הפלואורסצנט הירוק (GFP) חלבון 4 או 5 aequorin ממוקד המיטוכונדריה הקלו מאוד מדידת דינמיקה סידן המיטוכונדריה. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה בתגובה לגירויים שונים. השיטה מבוססת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי של "ratiometric-pericam" אשר מיועד סלקטיבי המיטוכונדריה. Pericam Ratiometric הוא אינדיקטור סידן על בסיס היתוך של חלבון permuted מעגלית ניאון צהוב calmodulin 4. עקידת סידן pericam ratiometric גורמת לשינוי של שיא עירור שלה nm 415-494 ננומטר, בעוד ספקטרום פליטה, אשר פסגות סביב 515 ננומטר, נשאר ללא שינוי. Ratiometric pericam נקשר יון סידן אחד עם ניתוק קבוע במבחנה של 1.7 מיקרומטר ~ 4. אלה המאפיינים של pericam ratiometric לאפשר כימות של שינויים מהירים לטווח ארוך בריכוז הסידן המיטוכונדריה. יתר על כן, אנו מתארים הסתגלות של מתודולוגיה זו מיקרוסקופ סידן תקן רחב בתחום ההדמיה עם מערכות הסינון זמין בדרך כלל. השימוש בשתי אגוניסטים ברורים, אגוניסט ATP purinergic ו אפופטוזיס וישכנע staurosporine התרופה, אנו מוכיחים כי שיטה זו היא המתאימה לניטור שינויים בריכוז הסידן המיטוכונדריה עם רזולוציה הזמני של שניות שעות. יתר על כן, אנחנו גם מראים כי pericam ratiometric שימושית גם עבור ביקוע מדידת הפיצול המיטוכונדריה / במהלך אפופטוזיס. לפיכך, pericam ratiometric הוא גם מתאים במיוחד למדידת לטווח ארוך מתמשך של הדינמיקה סידן המיטוכונדריה במהלך אפופטוזיס.
Protocol
1. Pericam-MT transfection הכנה Cell.
- פלייט תאים הלה אמש transfection על coverslips זכוכית סטרילית להציב צלחת 6-טוב תקן תרבות.
- הכן את ה-DNA / Lipofectamine 2000 מתחמי כפי שהוצע על ידי היצרן (Invitrogen). אנו משתמשים 4 מיקרוגרם של וקטור ratiometric-pericam-MT הביטוי 10 μL של 2000 Lipofectamine מדולל 0.5 מ"ל של Opti-ממ טוב עבור כל אחד. התאים צריכים להיות ~ ומחוברות 70% לפני transfection.
- החלף הלה תרבות המדיה (שונה Dulbecco של נשרים בינוני, 10% FBS, פניצילין / סטרפטומיצין) בכל טוב עם 1.5 מ"ל של התקשורת אותו ללא אנטיביוטיקה.
- מוסיפים את ה-DNA / Lipofectamine מתחמי זה טוב להיות transfected. מערבבים בעדינות עם נדנדה דגירה של 4 שעות תרבית תאים החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- החלף אנטיביוטי ללא מדיה עם התקשורת בתרבות עם אנטיביוטיקה. אפשר תאים להביע pericam ratiometric עבור 1-2 ימים לפני הדמיה.
2. מיקרוסקופ התקנה רכישת תמונה
- מניחים coverslip עם תאים הלה לתא הדמיה המתאים פתרון הדמיה: 107 מ"מ NaCl, KCl 7.2mM, 1.2 מ"מ MgCl 2, 1mm CaCl 2, 11.5mM גלוקוז, 0.1% אלבומין בסרום שור, ו HEPES 20mm 7.2. המעבדה שלנו משתמשת תא תא Attofluor מן Invitrogen. הר קאמרית הדמיה בשלב מיקרוסקופ הפוכה.
- מצא שטח של עניין המכיל אחד או יותר תאים להביע pericam ratiometric באמצעות טבילה 40X (או יותר) המטרה שמן. מצאנו כי pericam ratiometric הוא עמיד פחות photobleaching ב 380 ננומטר, ולכן אנו משתמשים באורך גל מתאים כדי לזהות תאים. לתמונות רכשה באיור 1, מטרה Superfluor ניקון 40X עם צמצם 1.3 מספרית היה בשימוש. מטרות בהגדלה גבוהה גם יהיה מתאים (60-100x). מסננים עירור שננקטו Chroma מסננים טכנולוגיה D380/30x (380 + / - 30 ננומטר) D495/10 (495 + / - 5 ננומטר), היה beamsplitter 505DCXR (505nm longpass), ואת פליטת לסנן היה HQ535/50m (535 + / - 25nm).
מיקרוסקופ שלנו נהגו לרכוש את התמונות באיור 1 מורכב מיקרוסקופ Nikon TE2000 הפוך מצויד מדעי רופר Coolsnap HQ מקורר מצלמת CCD, Ludl MAC6000 מהיר גלגל לסנן מחליף, וכן רכישת נתונים MetaFluor ותוכנה ניתוח. פרוטוקול זה ניתן להתאים כל מיקרוסקופ רחב בתחום סטנדרטי עם מסננים מתאימים התוכנה מסוגלת ללכוד ועיבוד תמונות ratiometric. - הגדרת תוכנה עבור עירור כפול באמצעות 495 ו - 380 מסנני ננומטר. סידן מחייב pericam ratiometric מגביר ספיגת ב 495 ננומטר, ולכן היחס צריך להיות מוגדר להיות 495 nm/380 ננומטר.
Ratiometric pericam יש סידן ללא עירור שיא ב 415 ננומטר 4. בפרוטוקול זה אנו ממליצים להשתמש ננומטר 380 לסנן רק משום שהוא נמצא בכל מקום במעבדות הדמיה ביותר לסידן. אם מסנן 410 ננומטר זמין, עדיף כדי לסנן את 380 ננומטר. - רכישת תמונות ברצף על ידי מרגש לחילופין ב 495 ו 380 ננומטר. לרכוש תמונות של רמות הסידן הבסיסית במשך לפחות 30 שניות לפני היישום של אגוניסט באמצעות מנגנון זלוף. סמן את הזמן בנוסף עבור כל אגוניסט. פעמים חשיפה מרווחי הרכישה צריך להיות מותאם למנוע photobleaching תוך מתן resolution.For מספקת דוגמה הזמני, עבור חצי מהיר הדינמיקה סידן פיקוח בתגובה לגירוי אגוניסט, תמונות נרכשו כל שתי שניות ב 1B דמויות ו-C הרבה יותר מהר שיעורי הרכישה גם אפשרי 6. לטווח ארוך הדמיה לאחר מתן staurosporine נרכשה עם מרווח יותר (ה -30) בין רכישות (איורים 1 D ו-E).
3. עיבוד תמונה וניתוח
- לאחר הניסוי הושלם, תמונות שהושגו ניתן לנתח במצב לא מקוון. הגדרת אזורים של עניין (ROI) שבו אתם רוצים לעקוב אחר השינויים ברמות הסידן. השתמש ROI נבחרים בתוך שטח ריק של השדה כדי לחסר הרקע במידת הצורך. יצוין כי המיטוכונדריה הם ניעתי די דינמי, ואירועים וחיוץ ב mitochondrion אחת על פני תקופות המורחבת לא תמיד אפשרי. לפיכך, בהתחשב תנועתיות גבוהה של אברון זה בכמה סוגי תאים, מבחר של ההחזר על ההשקעה צריכה להיות במעקב צמוד. יתר על כן, כפי שעולה איור 1, בתגובה המיטוכונדריה הטרוגני לגירויים שונים. לכן חשוב לנתח נתונים מקוון לפקח RO1 השמה על בסיס מסגרת לפי מסגרת. תיאור מפורט של מדידת סידן המיטוכונדריה מאוד המיטוכונדריה ניעתי תוארה במקומות אחרים 7.
- מדידות יחס המתקבל ROI יכול להיות מיובאים לתוך Excel או graphingsoftware דומה. נתונים ניתן להציג שמץ המייצג שינויים ברמות הסידן המיטוכונדריה בתא בודד או mitochondrion בודד, או בממוצע flאותות uorescence מ ROI מספר. יש לנו גם השתמשו בטכניקה זו כדי למדוד את רמות הסידן הממוצעת המיטוכונדריה אוכלוסייה של לימפוציטים שעברו אפופטוזיס המושרה על ידי Fas ליגנד 8.
4. נציג תוצאות:
באיור 1. (א) לוקליזציה subcellular של ratiometric-pericam-Mt. זו התמונה הראשונה מציגה לחיות תא הלה הביע ratiometric-pericam-Mt. התמונה השנייה מציגה מכתים ניאון עם mitochondrion סלקטיבית MitoTracker CMXRos צבען האדום. פלואורסצנטי צהוב בתמונה הממוזג מדגים שיתוף לוקליזציה של ratiometric-pericam-MT ו - פלואורסצנציה MitoTracker. (B) סדרה של יחס pseudocolor (495:380 ננומטר) תמונות של 4 תאים הלה הביע MT-ratiometric pericam שטופלו 10 mM ATP . (C) כימות של השינויים ברמות הסידן המיטוכונדריה באזור של עניין (ROI) המצוין סדרה (ב) (ד) שטופלו עם 10 mM ATP. יחס pseudocolor (495:380 ננומטר) תמונות של תא הלה הביע הר -ratiometric pericam שטופלו staurosporine 0.5 מיקרומטר. הטרוגניות בתגובה הסידן במיטוכונדריה הפרט בא לידי ביטוי, כמו גם פיצול משמעותי של המיטוכונדריה של 60 דקות. המיטוכונדריה יש עליות oscillatory בסידן (ראש חץ לבן), ואילו אחרים אינם מראים שינויים משמעותיים ברמת הסידן (ראש חץ צהוב). (E) כימות עליות גלובלי רמות הסידן המיטוכונדריה בתא הלה יחיד לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס עם 0.5 מיקרומטר staurosporine.
Discussion
כאן אנו מציגים שיטה מאוד פשוטה למדידת סידן המיטוכונדריה באמצעות המיטוכונדריה במיקוד pericam ratiometric. כפי שניתן לראות בתרשים 1 א ', באמצעות תקן widefield אופטיקה עם deconvolution לא ניתן להציג בקלות את המיטוכונדריה בתאים בודדים הלה עם יחס אות לרעש מקובל. הסיבה לכך היא כי תאים הלה, כמו רוב התאים בתרבית, מחוץ לשטח באופן משמעותי כאשר חסיד obviating את הצורך מיקרוסקופיה confocal או ציוד מיוחד אחר. מצאנו תוצאות דומות בתאים Jurkat דבק poly-ליזין coverslips מצופה 8. בניגוד מתודולוגיות באמצעות צבעים, אותו ניתן גם הלא פולשני לעקוב אחר רמות סידן המיטוכונדריה שעות באינדיקטורים סידן מקודדים גנטית כגון pericam ratiometric (איור 1E). זה חשוב במיוחד בעת ניתוח סידן המיטוכונדריה במהלך מוות של תאים. יתר על כן, אפשר גם לדמיין ביקוע / פיצול של המיטוכונדריה במהלך תהליך אפופטוטיים. כפי שמוצג 1D דמויות ו-E, טיפול staurosporine גורמת לעלייה איטית סידן subpopulations לבחור מתוכם פסגות המיטוכונדריה ב 20 דקות. רמות סידן לרדת שוב במקביל עם פיצול המיטוכונדריה לפני הולך שוב 2 שעות לאחר הטיפול. זה עולה בקנה אחד עם גלים איטיים בסידן cytosolic המושרה על ידי טיפול staurosporine שנמדדו באמצעות Fura-2 9. לפיכך, מידע חשוב הקינטית ניתן להשיג דבר שאינו אפשרי עם שיטות העסקת מדידות סטטי. למרות הצגנו יחסי ולא ריכוזי הסידן באיור 1, ניתן לכייל את החיישן באתרו לחשב רמות הסידן מוחלט 4, 10. אזהרה אחת חשובה שיש לקחת בחשבון הוא כי pericam ratiometric רגיש pH 4, 10. כמו גם רמות ה-pH cytosolic ואת המיטוכונדריה יכולה להשתנות באופן דרמטי במהלך 11 אפופטוזיס, זה שיקול חשוב. טיטרציה של pH ב pericam מבודד להביע המיטוכונדריה להוכיח כי הגדלת [H +] מגדיל פליטת pericam כאשר נרגש ב 495 ננומטר, עם השפעה מועטה על פליטה מאולצת על ידי עירור ב 410 ננומטר, מאפיין אשר נוצל למדוד בו זמנית הן סידן המיטוכונדריה ו pH 12. לכן, באופן סלקטיבי ניטור פליטה עם עירור 410 ננומטר מספק אמצעי סידן שאינם ratiometrically לפקח המיטוכונדריה בדאגה מופחת עבור ה-pH. לבסוף, את הפרוטוקול המוצגים כאן רק מחייב גישה מיקרוסקופ epifluorescent סטנדרטי עם מסנני זמינים באופן נרחב, ובכך טכניקה זו נגישה ביותר במעבדות.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
ברצוננו להודות Atsushi מיאווקי לספק לנו לבנות ratiometric-pericam-MT הביטוי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק GM081685 מן המכונים הלאומיים לבריאות (DB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon Instruments | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. |
| Imaging Software | Molecular Devices | Metafluor | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Hajnoczky, G. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Miyawaki, A. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Shimozono, S. Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein. Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).
- Wozniak, A. L. Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).
- Boehning, D. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).
- Csordas, G. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
