Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor real-time meting van mitochondriale calcium fluxen door fluorescerende beeldvorming. De methode maakt gebruik van een circulair gepermuteerd YFP-gebaseerde dual-excitatie ratiometrische calcium sensor (ratiometrische pericam-mt) selectief, uitgedrukt in mitochondriën.
Abstract
Dynamische veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie in reactie op verschillende stimuli reguleert vele cellulaire processen zoals proliferatie, differentiatie en apoptose 1. Tijdens apoptose, calcium ophoping in mitochondriën stimuleert het vrijkomen van pro-apoptotische factoren uit de mitochondriën in het cytosol 2. Het is daarom van belang om mitochondriale calcium rechtstreeks te meten in levende cellen in situ tijdens de apoptose. Hoge-resolutie fluorescerende beeldvorming van cellen geladen met dual-excitatie ratiometrische en niet-ratiometrische synthetische calcium indicator kleurstoffen heeft bewezen een betrouwbare en veelzijdige tool om de verschillende aspecten van de intracellulaire calcium signaaloverdracht studie. Het meten van cytosolische calcium fluxen met behulp van deze technieken is relatief eenvoudig. Echter, het meten van intramitochondrial calciumspiegels in intacte cellen met behulp van synthetische calcium indicatoren, zoals Rhod-2 en Rhod-FF is een grotere uitdaging. Synthetische indicatoren gericht op de mitochondriën zijn afgestompte reacties op herhaalde toename van de mitochondriale calcium, en verstoren mitochondriale morfologie 3. Bovendien, synthetische indicatoren hebben de neiging om uit te lekken van mitochondriën gedurende enkele uren waardoor ze ongeschikt zijn voor de lange termijn experimenten. Zo zijn genetisch gecodeerd calcium indicatoren die gebaseerd zijn op groen fluorescerend eiwit (GFP) 4 of 5 aequorine gericht op de mitochondria aanzienlijk vergemakkelijkt het meten van de mitochondriale calcium dynamiek. We beschrijven hier een eenvoudige methode voor het real-time meting van mitochondriale calcium fluxen in reactie op verschillende stimuli. De methode is gebaseerd op fluorescentie microscopie van 'ratiometrische-pericam', die selectief is gericht op mitochondriën. Ratiometrische pericam is een calcium-indicator gebaseerd op een fusie van circulair gepermuteerd geel fluorescerend eiwit en calmodulin 4. Binding van calcium aan ratiometrische pericam veroorzaakt een verschuiving van de excitatie piek van 415 nm tot 494 nm, terwijl de emissie spectrum, dat pieken rond 515 nm, blijft ongewijzigd. Ratiometrische pericam bindt een calcium-ion met een dissociatieconstante in vitro van ~ 1,7 uM 4. Deze eigenschappen van ratiometrische pericam kan de kwantificering van een snelle en lange-termijn veranderingen in de mitochondriale calcium concentratie. Daarnaast beschrijven we de aanpassing van deze methodologie op een standaard wide-field calcium imaging microscoop met algemeen beschikbare filter sets. Met behulp van twee verschillende agonisten, de purinerge agonist ATP en apoptose-inducerende geneesmiddelen staurosporine, tonen we aan dat deze methode geschikt is voor het monitoren van veranderingen in het mitochondriale calcium concentratie met een temporele resolutie van seconden tot uren. Verder hebben we ook laten zien dat ratiometrische pericam ook nuttig is voor het meten van mitochondriale kernsplijting / fragmentatie tijdens apoptose. Zo is ratiometrisch pericam bijzonder goed geschikt voor continue lange termijn meting van mitochondriale calcium dynamiek tijdens apoptose.
Protocol
1. Pericam-mt Transfectie en Cell voorbereiding.
- Plaat HeLa cellen de nacht voor transfectie op steriele glazen dekglaasjes geplaatst in een standaard 6-well cultuur plaat.
- Bereid DNA / Lipofectamine 2000 complexen zoals voorgesteld door de fabrikant (Invitrogen). We maken gebruik van 4 ug van ratiometrische-pericam-mt expressievector en 10 pi van Lipofectamine 2000 verdund in 0,5 ml van de Opti-MEM voor elk putje. De cellen moeten ~ 70% confluent voor transfectie zijn.
- Vervang HeLa cultuur media (Dulbecco's gewijzigd adelaars medium, 10% FBS, penicilline / streptomycine) in elk putje met 1,5 ml van dezelfde media zonder antibiotica.
- Voeg de DNA / Lipofectamine complexen aan elk putje te worden getransfecteerd. Meng voorzichtig met schommelen en incubeer gedurende 4 uur in een cel cultuur incubator bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Vervang de antibiotica-vrije media met de cultuur media met antibiotica. Laat cellen om ratiometrische pericam te uiten voor 1-2 dagen voor de beeldvorming.
2. Microscoop Setup en Image Acquisition
- Plaats een dekglaasje met HeLa cellen in een geschikte beeldvormende kamer met imaging-oplossing: 107mm NaCl, KCl 7.2mm, 1.2mm MgCl2, 1 mM CaCl2, 11.5mm glucose, 0,1% bovine serum albumine, en 20mm HEPES 7.2. Ons laboratorium maakt gebruik van de Attofluor cel kamer van Invitrogen. Monteer de beeldvorming kamer in een omgekeerde microscoop podium.
- Zoek een gebied van belang die een of meer cellen die ratiometrische pericam met behulp van een 40x (of hoger) olie-immersie objectief. We hebben ontdekt dat ratiometrische pericam is minder bestand tegen fotobleken bij 380 nm, en dus gebruiken we deze golflengte om geschikte cellen te identificeren. Voor de beelden die in figuur 1, was een Nikon Superfluor 40X objectief met een 1,3 numerieke apertuur gebruikt. Hogere vergroting doelstellingen zou passend zijn ook (60-100x). Gebruikte excitatie filters werden Chroma Technology filters D380/30x (380 + / - 30 nm) en D495/10 (495 + / - 5 nm), beamsplitter was 505DCXR (505nm longpass), en de emissie filter was HQ535/50m (535 + / - 25Nm).
Onze microscoop gebruikt om de afbeeldingen in figuur 1 bestaat uit een Nikon TE2000 omgekeerde microscoop uitgerust met een Roper Scientific Coolsnap HQ gekoelde CCD-camera, Ludl MAC6000 snelle filter wiel en de wisselaar, en een MetaFluor data acquisitie en analyse software. Dit protocol kan worden aangepast aan elke standaard wide-field microscoop met de juiste filters en software in staat is van het vastleggen en verwerken van ratiometrische afbeeldingen. - Het opzetten van de software voor dual excitatie het gebruik van de 495 en 380 nm filters. Calcium binding aan ratiometrische pericam verhoogt absorptie bij 495 nm, waardoor de verhouding moet worden ingesteld om te worden 495 nm/380 nm.
Ratiometrische pericam heeft een calcium-vrije excitatie piek bij 415 nm 4. In dit protocol adviseren wij het gebruik van een 380 nm filter alleen omdat het alomtegenwoordig is in de meeste calcium imaging laboratoria. Als een 410 nm filter beschikbaar is, verdient het de voorkeur om de 380 nm filter. - Acquire beelden achter elkaar door afwisselend spannend 495 en 380 nm. Acquire beelden van baseline calcium waarden voor ten minste 30 s voor de toepassing van de agonist via een perfusie apparaat. Markeer de toevoeging voor elke agonist. Belichtingstijden en acquisitie intervallen moet worden geoptimaliseerd om te voorkomen dat fotobleken terwijl die voldoende tijd resolution.For voorbeeld, voor semi-snelle calcium dynamiek gevolgd in reactie op agonist stimulatie, werden beelden die elke twee seconden in de figuren 1B en C. Veel sneller overname tarieven zijn ook mogelijk 6. Op lange termijn imaging na staurosporine toediening werd verworven met een langere interval (30 sec) tussen overnames (Figuren 1 D en E).
3. Image Processing and Analysis
- Zodra het experiment is voltooid, kan worden verkregen beelden worden geanalyseerd offline. Definieer de regio's of interest (ROI) in die u wilt veranderingen in de calcium-spiegels te controleren. Gebruik een ROI geselecteerd in een leeg gebied van het veld op de achtergrond af te trekken indien nodig. Opgemerkt moet worden dat de mitochondriën zijn zeer beweeglijk en dynamisch, en het extrapoleren van evenementen in een mitochondrion gedurende langere perioden is het niet altijd mogelijk. Dus, gezien de hoge beweeglijkheid van dit organel in sommige celtypes, moet de selectie van ROI zorgvuldig worden gecontroleerd. Bovendien, zoals blijkt uit figuur 1, mitochondria reactie heterogeen op verschillende stimuli. Het is daarom belangrijk te analyseren data offline en RO1 plaatsing op een frame-by-frame basis te controleren. Een gedetailleerde beschrijving van het meten van mitochondriale calcium in zeer beweeglijke mitochondria is elders 7 beschreven.
- Verkregen verhouding metingen van de ROI kan worden geïmporteerd in Excel of vergelijkbare graphingsoftware. De gegevens kunnen worden gepresenteerd als een trace die veranderingen in de mitochondriale calcium niveaus in een enkele cel of een mitochondrion, of gemiddeld fluorescence signalen van verschillende ROI. We hebben ook gebruik gemaakt van deze techniek gemiddelde mitochondriale calcium niveaus in een populatie van lymfocyten ondergaan apoptose geïnduceerd door Fas ligand 8 te meten.
4. Representatieve resultaten:
Figuur 1. (A) subcellulaire lokalisatie van ratiometrische-pericam-mt. Deze eerste afbeelding toont live HeLa cel die ratiometrische-pericam-mt. De tweede afbeelding toont fluorescerende kleuren met mitochondrion-selectieve kleurstof MitoTracker Red CMXRos. De gele fluorescentie in de samengevoegde afbeelding toont co-lokalisatie van ratiometrische-pericam-mt en MitoTracker fluorescentie. (B) Een reeks van pseudocolor ratio (495:380 nm) beelden van de vier HeLa cellen die mt-ratiometrische pericam die werden behandeld met 10 mM ATP . (C) Kwantificering van veranderingen in de mitochondriale calcium niveaus in de regio van belang (ROI), vermeld in (B) die werden behandeld met 10 mM ATP. (D)-serie van pseudocolor ratio (495:380 nm) beelden van een HeLa cel die mt -ratiometrische pericam behandeld met 0,5 uM staurosporine. Heterogeniteit in de calcium-respons in de afzonderlijke mitochondriën is evident, evenals sterke versnippering van de mitochondria met 60 minuten. Sommige mitochondriën hebben oscillerende toename van de calcium (witte pijlpunt), terwijl anderen geen significante veranderingen in de calcium-niveau (gele pijl hoofd). (E) Kwantificering van de toename van de wereldwijde mitochondriale calcium niveau in een HeLa cel na inductie van apoptose met 0,5 uM staurosporine.
Discussion
Hier presenteren wij een zeer eenvoudige methode voor het meten van mitochondriale calcium met behulp van mitochondriaal-gerichte ratiometrische pericam. Zoals weergegeven in Figuur 1A, met behulp van standaard groothoek optiek met geen deconvolutie is het mogelijk om gemakkelijk de individuele mitochondria bekijken in HeLa cellen met acceptabele signaal-ruisverhouding. Dit komt omdat HeLa cellen, zoals de meeste cellen in cultuur, significant plat wanneer aanhanger wegnemen van de noodzaak voor confocale microscopie of andere gespecialiseerde apparatuur. Wij hebben gevonden soortgelijke resultaten in Jurkat cellen gehandeld op grond van poly-lysine gecoate dekglaasjes 8. In tegenstelling tot de methodes met behulp van kleurstoffen, is het ook mogelijk om niet-invasieve mitochondriale calcium-monitor voor uren gebruik van genetisch gecodeerd calcium indicatoren, zoals ratiometrische pericam (figuur 1E). Dit is vooral belangrijk bij het analyseren van mitochondriale calcium tijdens celdood. Bovendien is het ook mogelijk om kernsplijting / fragmentatie van mitochondria visualiseren tijdens het apoptotische proces. Zoals in de figuren 1D en E, staurosporine behandeling veroorzaakt een langzame toename van de calcium in bepaalde subpopulaties van de mitochondriën, die pieken op 20 minuten. Calciumgehalte gaan weer met mitochondriale fragmentatie gelijktijdig voordat je weer twee uur na de behandeling. Dit is consistent met de langzame golven in cytosol veroorzaakt door calcium gemeten staurosporine behandeling met behulp van Fura-2 9. Zo kunnen belangrijke kinetische informatie worden verkregen die niet mogelijk is met methoden gebruik statische metingen. Hoewel we hebben gepresenteerd ratio's en niet calcium concentraties in figuur 1, is het mogelijk om de sensor te kalibreren in situ van absolute calcium niveau 4, 10 te berekenen. Een belangrijk voorbehoud om te overwegen is dat ratiometrisch pericam is gevoelig voor pH 4, 10. Omdat zowel de cytosolische en mitochondriale pH-waarde kan drastisch veranderen tijdens apoptosis 11, is dit een belangrijke overweging. Titratie van de pH in geïsoleerde mitochondria uiten pericam aan te tonen dat een verhoging van [H +] verhoogt de uitstoot van pericam toen opgewonden 495 nm, met weinig effect op de uitstoot gestimuleerd wordt door excitatie bij 410 nm, een woning die is benut om gelijktijdig meten van zowel de mitochondriale calcium en pH 12. Zo selectief controle emissie met 410 nm excitatie biedt een middel om niet-ratiometrically monitoren mitochondriale calcium met een verminderde zorg voor de pH. Ten slotte is het protocol hier gepresenteerde vereist alleen toegang tot een standaard epifluorescerende microscoop met op grote schaal beschikbaar filters, waardoor deze techniek toegankelijk voor de meeste laboratoria.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Atsushi Miyawaki bedanken voor het verstrekken van ons de ratiometrische-pericam-mt expressie-construct. Dit werk werd ondersteund door subsidie GM081685 van de National Institutes of Health (DB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon Instruments | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. |
| Imaging Software | Molecular Devices | Metafluor | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Hajnoczky, G. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Miyawaki, A. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Shimozono, S. Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein. Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).
- Wozniak, A. L. Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).
- Boehning, D. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).
- Csordas, G. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
