Summary
이 프로토콜은 형광 이미징에 의해 mitochondrial 칼슘 fluxes의 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 이 메서드는 선택 mitochondria로 표현 circularly permutated YFP 기반 듀얼 여기 ratiometric 칼슘 센서 (ratiometric pericam - MT)을 활용합니다.
Abstract
다양한 자극에 대한 응답으로 세포 내 칼슘 농도의 동적 변화는 확산, 분화 및 apoptosis 한 많은 세포 과정을 조절. mitochondria에서 apoptosis, 칼슘 축적하는 동안 프로 apoptotic 요소의 릴리스는 cytosol이에 mitochondria에서 추진하고 있습니다. 직접 apoptosis 동안 현장에서 살아있는 세포에서 mitochondrial 칼슘을 측정하기 위해 관심을 따라서이다. 듀얼 여기 ratiometric 및 비 ratiometric 합성 칼슘 지표 염료와 함께 로드된 세포의 고해상도 형광 이미징은 세포내 칼슘 신호의 다양한 측면을 연구하기위한 신뢰성과 다양한 도구로 입증되었습니다. 이러한 기술을 사용 cytosolic 칼슘 fluxes을 측정하는 것은 비교적 간단합니다. 그러나,로드 '- 2 및로드'- FF로 합성 칼슘 지표를 사용하여 손상 세포 intramitochondrial 칼슘 수준을 측정하는 것은 더욱 어려운 것입니다. mitochondria를 타겟으로 합성 지표 mitochondrial 칼슘 반복 증가에 대한 답변을 무딘하고, mitochondrial 형태학에게 3 중단합니다. 또한, 합성 지표는 장기적인 실험들이 적합하게 몇 시간 동안 mitochondria 밖으로 누설하는 경향이있다. 따라서, mitochondria를 타겟으로하는 녹색 형광 단백질 (GFP) 4 aequorin 5를 기반으로 유전자 인코딩 칼슘 지표는 크게 mitochondrial 칼슘 역학의 측정을 촉진합니다. 여기, 우리는 다른 자극에 대한 응답으로 mitochondrial 칼슘 fluxes의 실시간 측정을위한 간단한 방법을 설명합니다. 방법을 선택 mitochondria을 타겟으로하는 'ratiometric - pericam'의 형광 현미경을 기반으로합니다. Ratiometric pericam는 circularly permuted 노란색 형광 단백질과 calmodulin 4 핵융합 기반으로 칼슘 표시기입니다. 방출 스펙트럼, 봉우리 주변에 515 nm의은 변함이 동안 ratiometric pericam에 칼슘의 바인딩은 415 nm의에 494 nm의 여기로부터 피크의 변화가 발생합니다. Ratiometric pericam는 ~ 1.7 μm의 4 체외에서 상수를 분리하여 하나의 칼슘 이온을 바인딩합니다. ratiometric pericam 이러한 특성 mitochondrial 칼슘 농도에 신속하고 장기적인 변화의 부량을 허용합니다. 또한, 우리는 일반적으로 사용 가능한 필터 세트와 표준 넓은 분야 칼슘 이미징 현미경이 방법의 적응을 설명합니다. 별개의 두 agonists, purinergic 작용제 ATP와 apoptosis - 유도하는 약물 staurosporine을 사용하여, 우리는이 방법은 시간이 초 시간적 해상도 mitochondrial 칼슘 농도의 변화를 모니터링에 적합한 것을 보여줍니다. 또한, 우리는 ratiometric pericam 또한 apoptosis 동안 mitochondrial 분열 / 조각을 측정하는 데 유용 것을 보여줍니다. 따라서 ratiometric pericam은 특히 apoptosis 동안 mitochondrial 칼슘 역학의 지속적인 장기 측정에 가장 적합합니다.
Protocol
1. Pericam - MT의 Transfection 및 세포 준비.
- 표준 6 자 문화 플레이트에 위치 멸균 유리 coverslips에 transfection 전에 플레이트 헬라 세포는 밤.
- 제조 업체 (Invitrogen)에 의해 제안으로 DNA / Lipofectamine 2000 단지를 준비합니다. 우리는 ratiometric - pericam - MT 발현 벡터 4 μg 각 잘 대해 Opti - 멤 0.5 ML에 희석 Lipofectamine 2000 10 μL를 사용합니다. 세포는 transfection 전에 ~ 70 %의 합류해야합니다.
- 항생제없이 동일한 미디어 1.5 ML 각 우물에 헬라 문화 미디어 (Dulbecco의 수정 독수리 중간 10 % FBS, 페니실린 / 스트렙토 마이신) 교체합니다.
- 각 잘 transfected 수에 DNA / Lipofectamine 단지를 추가합니다. 37 O C 5 % CO 2에서 세포 문화 인큐베이터에서 4 시간 동안 신나게 부화와 함께 부드럽게 섞는다.
- 항생제와 문화 매체와 항생제없이 미디어를 교체합니다. 세포 이미징 전에 1-2일에 대한 ratiometric pericam을 표현하도록 허용합니다.
2. 현미경 설정 및 이미지 수집
- 107mM NaCl, 7.2mM KCl, 1.2mM MgCl 2, 1mM CaCl 2, 11.5mM 포도당, 0.1 % 소 혈청 알부민 및 20mM HEPES 7.2 : 이미징 솔루션을 적절한 이미지 챔버에 헬라 세포와 coverslip를 놓습니다. 저희 연구실은 Invitrogen에서 Attofluor 셀 챔버를 사용합니다. 거꾸로 현미경 단계에있는 이미징 챔버를 탑재합니다.
- 40x (또는 이상) 기름 침지 목표를 사용하여 ratiometric pericam을 표현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 관심 영역을 찾아보십시오. 우리는 ratiometric pericam은 380 nm의에서 photobleaching 적은 강한 것으로 나타났습니다, 그래서 우리는 적당한 세포를 식별이 파장을 사용합니다. 그림 1에서 가져온 이미지의 경우, 1.3 조리개 수치와 니콘 Superfluor 40X 목적은 사용되었다. 높은 배율의 목표는 (60 - 100x) 적절한 것입니다. 사용 여기 필터는 채도 기술 필터 D380/30x했다 (380 + / - 30 nm의)과 D495/10 (495 + / - 5 nm의), beamsplitter가 505DCXR (505nm longpass)이었고, 방사 필터 HQ535/50m (535도 + /되었습니다 - 25nm).
그림 1의 이미지를 획득하는 데 사용되는 우리의 현미경 로퍼 과학 Coolsnap 사령부 CCD 카메라, Ludl MAC6000 빠른 필터 휠과 체인저 및 MetaFluor 데이터 수집 및 분석 소프트웨어를 냉각이 장착된 니콘 TE2000 거꾸로 현미경으로 구성되어 있습니다. 이 프로토콜은 적절한 필터와 ratiometric 이미지를 캡처하고 처리할 소프트웨어를 사용하여 모든 표준 와이드 필드 현미경을 적용할 수 있습니다. - 495 및 380 nm의 필터를 사용하여 이중 여기에 대한 소프트웨어를 설정합니다. ratiometric pericam에 바인딩 칼슘은 495 nm의 흡광도에서 증가, 따라서 비율은 495 nm의 nm/380로 설정해야합니다.
Ratiometric pericam은 415 nm의 4 칼슘 무료 여기 피크 있습니다. 그것이 대부분의 칼슘 이미징 연구소에서 유비 쿼터스 경우에만하기 때문에이 프로토콜에서 우리는 380 nm의 필터를 사용하는 것이 좋습니다. 410 NM 필터를 사용할 경우, 그것은 380 nm의 필터 것이 바람직합니다. - 495 및 380 nm의에 순차적으로 또는 흥미로운 이미지를 취득. 재관류 장치를 통해 작용제의 응용 프로그램을하기 전에 최소한 30 s에 대한 기준 칼슘 수준의 이미지를 취득. 각 작용제에 대한 추가 시간을 표시합니다. 노출 시간 및 수집 간격은 여전히 충분한 시간적 resolution.For 예제를 허용하면서 작용제의 자극에 대한 응답으로 모니터링 세미 신속한 칼슘 역학 위해 photobleaching 방지하기 위해 최적화해야 이미지가 인물 1B와 C. 더 빨리 획득 속도의 모든 이초을 인수했다 또한 6 가능합니다. staurosporine 관리 후 장기 영상은 인수 사이에 긴 간격 (30) (그림 1 D 및 E)를 함께 인수되었다.
3. 이미지 처리 및 분석
- 실험이 완료되면 얻은 이미지는 오프라인 분석하실 수 있습니다. 당신이 칼슘 수준의 변화를 모니터하고자하는 관심 영역 (ROI)을 정의합니다. 필요한 경우 배경을 뺄 분야의 빈 영역 내에서 선택한 투자 수익 (ROI)을 사용합니다. 그것은 mitochondria 꽤 운동성이있는 및 동적 것을 지적하고, 연장 기간 동안 하나의 mitochondrion에을 바탕 이벤트는 항상 그렇지는 않습니다하여야한다. 따라서, 몇몇 세포 유형이 organelle의 높은 운동성을 고려, 투자 수익 (ROI)의 선택은 신중하게 모니터링해야합니다. 또한, 그림 1, 다양한 자극에 heterogeneously mitochondria 대응 입증. 데이터를 오프라인으로 분석하고 프레임으로 프레임 단위로 RO1 배치를 모니터링하는 것이 중요하다. 높은 운동성이있는 mitochondria에 mitochondrial 칼슘을 측정하는 상세한 설명이 다른 일곱 설명되었습니다.
- 투자 수익 (ROI)에서 얻은 비율 측정은 Excel 또는 이와 유사한 graphingsoftware로 가져올 수 있습니다. 데이터는 단일 셀 또는 단일 mitochondrion에서 mitochondrial 칼슘 수준의 변화를 나타내는 성분으로 제시하거나, FL 평균 수여러 투자 수익 (ROI)에서 uorescence 신호. 우리는 또한 파 리간드 8 시까지 유도된 apoptosis를 겪고 lymphocytes의 인구의 평균 mitochondrial 칼슘 수준을 측정하는이 기술을 사용해 왔습니다.
4. 대표 결과 :
그림 1. ratiometric - pericam - 후지산 (A) Subcellular 지방화. 첫 번째 이미지는 ratiometric - pericam - MT을 표현 라이브 헬라 세포를 보여줍니다. 두 번째 이미지는 mitochondrion - 선택적 염료의 MitoTracker 레드 CMXRos과 형광 염색법을 보여줍니다. 병합된 이미지의 노란색 형광은 ratiometric - pericam - MT 및 MitoTracker의 형광의 공동 지방화를 보여줍니다. (B) pseudocolor 비율 (495:380 NM) 10 MM ATP 취급 MT - ratiometric pericam을 표현하는 4 헬라 세포의 이미지 일련의 . (C) 관심있는 영역 (ROI)에 mitochondrial 칼슘 수준의 변화 부량는 pseudocolor 비율 (495:380 NM) 후지산을 표현 헬라 세포의 이미지 (B) 10 MM ATP 취급. (D) 시리즈에 표시된 - ratiometric pericam 0.5 μm의의 staurosporine과 치료. 개인 mitochondria에있는 칼슘 응답에 이질은 분명뿐만 아니라 60분하여 mitochondria의 중요한 조각이다. 다른 칼슘 수준에서 큰 변화 (노란색 화살표 머리)를 표시하지 않습니다 반면 일부 mitochondria는, 칼슘 (흰색 화살표 머리)에 oscillatory 증가했습니다.와 apoptosis의 유도 후 하나의 헬라 세포의 글로벌 mitochondrial 칼슘 수준 증가 (E) 부량 0.5 μm의의 staurosporine.
Discussion
여기 mitochondrial 타겟 ratiometric pericam를 사용하여 mitochondrial 칼슘을 측정하는 매우 간단한 방법을 제시한다. 것처럼 쉽게 허용 신호 대 잡음 비율과 헬라 세포에서 개별 mitochondria를 볼 수 있습니다 없음 deconvolution 표준 위드 광학을 사용하여 그림 1A에 표시됩니다. 공촛점 현미경 또는 기타 전문 장비에 대한 필요성을 obviating 때 자기편 헬라 세포는 문화에 대부분의 세포처럼 크게 버리고 있기 때문입니다. 우리는 폴리 - 리신 코팅 coverslips 8 준수 Jurkat 세포에서 유사한 결과를 발견했다. 염료를 사용하는 방법을 대조적으로, 그것은 비 invasively 같은 ratiometric pericam (그림 1E)로 인코딩된 유전자 칼슘 표시기를 사용하여 시간 mitochondrial 칼슘 수준을 모니터링하는 것도 가능합니다. 세포 죽음 동안 mitochondrial 칼슘을 분석 때 특히 중요합니다. 또한, 그것은 apoptotic 과정에서 분열 / mitochondria의 조각을 시각화하는 것도 가능합니다. 와 같은 인물 1D와 E에 나타난 staurosporine 치료는 20 분 mitochondria있는 봉우리를 선택 subpopulations에서 칼슘 느린 증가됩니다. 칼슘 수준은 다시 이시간 치료 후 다시 올라가기 전에 mitochondrial 조각과 함께 수반하는 내려가. 이것은 Fura - 2 9를 사용하여 측정 staurosporine 처리에 의해 유도된 cytosolic 칼슘 느린 파도와 일치합니다. 따라서, 중요한 운동 정보가있는 정적 측정을 고용하는 방법으로 가능하지 않다 얻을 수 있습니다. 우리가 비율과 그림 1에없는 칼슘 농도를 제시했지만, 그것은 절대 칼슘 레벨 4, 10를 계산하기 위해 현장에서 센서를 보정하는 것이 가능합니다. 고려해야 할 한 가지 중요한 주의해야 할 점은 ratiometric pericam는 산도 4, 10 민감한 때문입니다. 모두 cytosolic 및 mitochondrial 산도 수준은 apoptosis 11 동안 극적으로 변화 수 있듯이, 이것은 중요한 고려 사항이다. 절연 mitochondria 표현 pericam에서 산도의 적정가 입증되는 증가 [H +] 증가 410 nm의에서 여기, 동시에 mitochondrial 칼슘을 모두 측정하는 악용되어 속성에 의해 자극 방출에 약간의 영향으로 495 nm의에서 흥분 pericam의 방출 및 산도 12. 따라서, 선택 410 나노미터 여기와 방출을 모니터링하는 것은 산도에 대한 감소 우려와 비 ratiometrically 모니터 mitochondrial 칼슘하기위한 수단을 제공합니다. 마지막으로, 여기에 제시된 프로토콜은 따라서 대부분의 실험실로이 기술을 이용할 수 있도록, 광범위하게 사용 가능한 필터와 표준 epifluorescent 현미경에 액세스할 수 있어야합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 ratiometric - pericam - MT 표현 구조와 함께 우리를 제공 아츠시 미야 와키 감사하고 싶습니다. 이 작품은 국립 보건원 (DB)에서 부여 GM081685에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon Instruments | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. |
| Imaging Software | Molecular Devices | Metafluor | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 |
References
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