Summary
Detta protokoll beskriver en metod för realtids mätning av mitokondrie-kalcium flöden av fluorescerande avbildning. Metoden utnyttjar ett cirkulärt permuteras YFP-baserade dubbla excitation ratiometrisk kalcium sensor (ratiometrisk pericam-mt) selektivt uttrycks i mitokondrierna.
Abstract
Dynamiska förändringar i intracellulär kalcium koncentration som svar på olika stimuli reglerar många cellulära processer såsom proliferation, differentiering och apoptos 1. Under apoptos, kalcium ackumuleras i mitokondrierna främjar frisättning av pro-apoptotiska faktorer från mitokondrier i cytosolen 2. Det är därför av intresse att direkt mäta mitokondrie kalcium i levande celler in situ under apoptos. Högupplöst fluorescerande avbildning av celler laddade med dubbla excitation ratiometrisk och icke-ratiometrisk syntetiska färgämnen kalcium Indikatorn har visat sig vara ett pålitligt och mångsidigt verktyg för att studera olika aspekter av intracellulär kalcium signalering. Mätning cytosoliskt kalcium flöden med hjälp av dessa tekniker är relativt enkelt. Att mäta intramitochondrial kalciumhalt i intakta celler med syntetiska kalcium indikatorer såsom Rhod-2 och Rhod-FF är mer utmanande. Syntetisk indikatorer riktade till mitokondrierna ha lindrat svar på repetitiva ökningar i mitokondriella kalcium, och störa mitokondriella morfologi 3. Dessutom syntetiska indikatorer tenderar att läcka ut från mitokondrier under flera timmar, vilket gör dem olämpliga för långtidsförsök. Därför har genetiskt kodade kalcium indikatorer baserade på grönt fluorescerande protein (GFP) 4 eller aequorin 5 riktade till mitokondrierna i hög grad underlättade mätningen av mitokondriell kalcium dynamik. Här beskriver vi en enkel metod för att i realtid mäta av mitokondriell kalcium flöden som svar på olika stimuli. Metoden är baserad på fluorescensmikroskopi av "ratiometrisk-pericam" som selektivt är riktad mot mitokondrier. Ratiometrisk pericam är en kalcium indikator bygger på en sammansmältning av cirkulärt permuterats gula fluorescerande protein och calmodulin 4. Bindningen av kalcium för att ratiometrisk pericam orsakar en förskjutning av excitation topp från 415 nm till 494 nm, medan spektrum, som toppar kring 515 nm, förblir oförändrad. Ratiometrisk pericam binder en enda kalcium jon med en dissociationskonstant in vitro på ~ 1,7 mikroM 4. Dessa egenskaper ratiometrisk pericam tillåter kvantifiering av snabba och långsiktiga förändringar i mitokondriernas kalcium koncentration. Dessutom beskriver vi anpassa denna metod till en standard brett fält kalcium imaging mikroskopet med vanliga filter set. Med hjälp av två olika agonister, den Purinergic agonist ATP och apoptos-inducerande läkemedel staurosporine, visar vi att denna metod är lämplig för att övervaka förändringar i mitokondriernas kalcium koncentration med en tidsupplösning av några sekunder till timmar. Dessutom visar vi också att ratiometrisk pericam är också användbart för att mäta mitokondriella fission / fragmentering under apoptos. Därför är ratiometrisk pericam särskilt väl lämpad för kontinuerlig och långsiktig mätning av mitokondrie kalcium dynamik under apoptos.
Protocol
1. Pericam-mt Transfektion och cellberedningen.
- Tavla HeLa celler kvällen innan transfektion på sterila glas täckglas placeras i en standard 6-bra kultur plattan.
- Förbered DNA / Lipofectamine 2000 komplex som föreslås av tillverkaren (Invitrogen). Vi använder 4 mikrogram ratiometrisk-pericam-mt uttryck vektor och 10 mikroliter av Lipofectamine 2000 utspädd i 0,5 ml Opti-MEM för varje brunn. Cellerna skall vara ~ 70% confluent innan transfektion.
- Byt HeLa odlingsmedia (Dulbecco ändrade Eagles medium, 10% FBS, penicillin / streptomycin) i varje brunn med 1,5 ml av samma media utan antibiotika.
- Lägg till DNA / Lipofectamine komplex i varje brunn som ska transfekterade. Blanda försiktigt med gungande och inkubera under 4 timmar i en cellkultur inkubator vid 37 ° C, 5% CO 2.
- Byt ut antibiotika-fria medier med kultur media med antibiotika. Låt cellerna att uttrycka ratiometrisk pericam i 1-2 dagar innan avbildning.
2. Mikroskop Installation och Image Acquisition
- Sätt på ett täckglas med HeLa celler till en lämplig bildteknik kammare med bildbehandling lösning: 107mm NaCl, 7.2mM KCl, 1,2 mm MgCl 2, 1mm CaCl 2, 11,5 mm glukos, 0,1% bovint serumalbumin, och 20 mm HEPES 7,2. Vårt laboratorium använder Attofluor cellen kammaren från Invitrogen. Montera avbildning kammare i ett inverterat mikroskop skede.
- Hitta ett område av intresse innehåller en eller flera celler som uttrycker ratiometrisk pericam med en 40x (eller högre) objektiv oljeimmersion. Vi har funnit att ratiometrisk pericam är mindre resistent mot fotoblekning vid 380 nm, och därför använder vi denna våglängd att identifiera lämpliga celler. För de bilder som förvärvats i figur 1, var en Nikon Superfluor 40X mål med en 1,3 numerisk bländare som används. Högre förstoring mål skulle också vara lämpligt (60-100x). Excitation använda filter var Chroma Teknik filter D380/30x (380 + / - 30 nm) och D495/10 (495 + / - 5 nm) var beamsplitter 505DCXR (505nm longpass), och utsläpp filtret var HQ535/50m (535 + / - 25nm).
Vår mikroskop som används för att förvärva bilderna i figur 1 består av en Nikon TE2000 inverterat mikroskop utrustat med en Roper vetenskaplig Coolsnap HQ kyls CCD-kamera, Ludl MAC6000 snabba filter hjul och växlare, och en MetaFluor datainsamling och analysprogram. Detta protokoll kan anpassas till alla standard breda fält mikroskop med lämpliga filter och programvara som kan fånga och bearbeta ratiometrisk bilder. - Ställ in programvaran för dubbla excitation med 495 och 380 nm filter. Kalcium bindning till ratiometrisk pericam ökar absorbansen vid 495 nm, vilket förhållandet bör inrättas för att vara 495 nm/380 nm.
Ratiometrisk pericam har ett kalcium-fri excitation topp vid 415 nm 4. I detta protokoll vi föreslår att du använder en 380 nm filter bara eftersom det är allmänt förekommande i de flesta laboratorier kalcium avbildning. Om en 410 nm filter är tillgänglig är det att föredra framför 380 nm filter. - Hämta bilder sekventiellt av alternativt spännande på 495 och 380 nm. Förvärva bilder av kalciumnivåer vid baseline i minst 30 sek före applicering av agonist via en perfusion apparat. Markera Dessutom tid för varje agonist. Exponeringstider och intervall förvärv bör optimeras för att förhindra fotoblekning samtidigt tillåta tillräckligt tidsmässiga resolution.For exempel för semi-snabb kalcium dynamik övervakas svar på agonist stimulering, var bilder förvärvades varannan sekund i figurerna 1B och C. Mycket snabbare priser förvärv Det är också möjligt 6. Långsiktiga avbildning efter staurosporine administration förvärvades med längre intervall (30s) mellan förvärv (figur 1 D och E).
3. Bildbehandling och analys
- När experimentet är klar kan erhållas bilderna analyseras offline. Definiera områden av intresse (ROI) som du vill att övervaka förändringar i kalcium nivåer. Använd en ROI väljas inom ett tomt område på fältet för att subtrahera bakgrunden om det behövs. Det bör noteras att mitokondrierna är ganska rörliga och dynamiska, och extrapolera händelser i en enda mitokondrier under längre perioder är inte alltid möjligt. Således, med tanke på den höga motilitet av denna organell i vissa celltyper, bör valet av ROI övervakas noggrant. Dessutom, vilket framgår i figur 1, mitokondrier svar ojämnt på olika stimuli. Det är därför viktigt att analysera data offline och övervaka RO1 placering på en bildruta för bildruta basis. En detaljerad beskrivning av mätning av mitokondriell kalcium i mycket rörliga mitokondrierna har beskrivits på annat håll 7.
- Framställda förhållandet mätningar från ROI kan importeras till Excel eller liknande graphingsoftware. Data kan presenteras som ett spår som representerar förändringar i mitokondriernas kalcium i en enda cell eller enstaka mitokondrier, eller i genomsnitt fluorescence signaler från flera ROI. Vi har också använt denna teknik för att mäta genomsnittlig mitokondrie kalcium i en population av lymfocyter som genomgår apoptos som induceras av Fas ligand 8.
4. Representativa resultat:
Figur 1. (A) subcellulära lokalisering av ratiometrisk-pericam-mt. Denna första bild visar leva HeLa cell som manifesterar ratiometrisk-pericam-mt. Den andra bilden visar fluorescerande färgning med mitokondrien-selektiva röd färg MitoTracker CMXRos. Den gula fluorescens i den sammanslagna bilden visar co-lokalisering av ratiometrisk-pericam-mt och MitoTracker fluorescens. (B) En serie pseudofärger ratio (495:380 nm) bilder av 4 HeLa celler som uttrycker mt-ratiometrisk pericam behandlades med 10 mM ATP . (C) Kvantifiering av förändringar i mitokondriernas kalciumhalt i regionen av intresse (ROI) som anges i (B) som behandlades med 10 mM ATP. (D) Serie av pseudofärger ratio (495:380 nm) bilder av en HeLa cell som manifesterar mt -ratiometrisk pericam som behandlats med 0,5 mikroM staurosporine. Heterogenitet i kalcium svar i enskilda mitokondrier är uppenbart, liksom betydande fragmentering av mitokondrier med 60 minuter. Vissa mitokondrierna har oscillerande ökningar kalcium (vit pil huvudet), medan andra inte visar signifikanta förändringar i kalcium nivå (gul pil huvudet). (E) Kvantifiering av ökningen av den globala mitokondriell kalcium i en enda HeLa cell efter induktion av apoptos med 0,5 mikroM staurosporine.
Discussion
Här presenterar vi en mycket enkel metod för att mäta mitokondriella kalcium med hjälp av mitokondrie-riktade ratiometrisk pericam. Som framgår av Figur 1A, med vanliga widefield optik utan deconvolution är det möjligt att enkelt visa enskilda mitokondrier i HeLa celler med godtagbar signal-brus-förhållande. Detta beror på HeLa celler, liksom de flesta celler i kultur, platta ut avsevärt när anhängare undanröja behovet av konfokalmikroskopi eller annan specialutrustning. Vi har funnit liknande resultat i Jurkat celler följs poly-lysin belagda täckglas 8. I motsats till metoder med hjälp av färger, är det också möjligt att icke-invasivt övervaka mitokondrie kalciumnivåer i timmar med hjälp av genetiskt kodade kalcium indikatorer såsom ratiometrisk pericam (figur 1E). Detta är särskilt viktigt vid analys av mitokondrie-kalcium under celldöd. Dessutom är det också möjligt att visualisera fission / fragmentering av mitokondrier under apoptotiska processen. Som visas i figur 1D och E orsakar staurosporine behandling en långsam ökning av kalcium i välja delpopulationer av mitokondrier, som toppar på 20 minuter. Kalciumnivåer gå ner igen samtidigt med mitokondrie fragmenteringen innan man går upp igen två timmar efter behandlingen. Detta är förenligt med den långsamma vågor i cytosoliskt kalcium inducerad av staurosporine mäts behandling med Fura-2 9. Därmed kan viktiga kinetiska information erhållas som inte är möjligt med metoder som använder statiska mätningar. Även om vi har presenterat nyckeltal och inte halter kalcium i figur 1 är det möjligt att kalibrera sensorn på plats för att beräkna absoluta kalciumnivåer 4, 10. Ett viktigt förbehåll att tänka på är att ratiometrisk pericam är känslig för pH 4, 10. Eftersom både cytosoliskt och mitokondrie pH-nivån kan förändras dramatiskt under apoptos 11, är detta en viktig faktor. Titrering av pH i isolerade mitokondrier uttrycka pericam visa att öka [H +] ökar utsläppen av pericam när den exciteras vid 495 nm, med liten effekt på utsläppen stimuleras av excitation vid 410 nm, en egendom som har utnyttjats för att samtidigt mäta både mitokondrie kalcium och pH 12. Således selektivt övervakning av utsläpp med 410 nm magnetisering ger en möjlighet till icke-ratiometrically monitor mitokondrie kalcium med minskad oro för pH. Slutligen krävs det protokoll som presenteras här bara tillgång till en standard epifluorescent mikroskop med allmänt tillgängliga filter, vilket gör denna teknik tillgänglig för de flesta laboratorier.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Atsushi Miyawaki för att ge oss den ratiometrisk-pericam-mt uttryck konstruktion. Detta arbete stöddes av bidrag GM081685 från National Institutes of Health (DB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon Instruments | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. |
| Imaging Software | Molecular Devices | Metafluor | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Hajnoczky, G. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Miyawaki, A. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Shimozono, S. Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein. Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).
- Wozniak, A. L. Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).
- Boehning, D. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).
- Csordas, G. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
