Summary
Ce protocole décrit une méthode pour mesurer en temps réel des flux de calcium mitochondrial par imagerie de fluorescence. La méthode tire parti d'une circulaire permuté YFP à base de capteurs de calcium à double excitation ratiométrique (ratiométrique pericam-mt) sélectivement exprimé dans les mitochondries.
Abstract
Changements dynamiques de la concentration de calcium intracellulaire en réponse à divers stimuli régule de nombreux processus cellulaires comme la prolifération, la différenciation et l'apoptose 1. Pendant l'accumulation de calcium apoptose, dans les mitochondries favorise la libération de facteurs pro-apoptotiques de la mitochondrie dans le cytosol 2. Il est donc intéressant de mesurer directement le calcium mitochondrial dans les cellules vivantes in situ lors de l'apoptose. Imagerie à haute résolution fluorescent de cellules chargées avec double excitation ratiométrique et non-ratiométrique colorants synthétiques indicateur de calcium a été prouvé être un outil fiable et polyvalent pour étudier divers aspects de la signalisation du calcium intracellulaire. Mesurer les flux de calcium cytosolique utilisant ces techniques est relativement simple. Toutefois, la mesure des niveaux de calcium dans les cellules intactes intramitochondriales en utilisant des indicateurs tels que le calcium synthétique Rhod-2 et Rhod-FF est plus difficile. Des indicateurs synthétiques destinés aux mitochondries ont émoussé les réponses aux augmentations répétitives en calcium mitochondrial, et perturber la morphologie mitochondriale 3. En outre, les indicateurs synthétiques ont tendance à s'échapper des mitochondries pendant plusieurs heures ce qui les rend impropres à long terme des expériences. Ainsi, les indicateurs de calcium codées génétiquement basé sur la protéine fluorescente verte (GFP) 4 ou 5 aequorine ciblée vers les mitochondries ont grandement facilité la mesure de la dynamique du calcium mitochondrial. Ici, nous décrivons une méthode simple pour mesurer en temps réel des flux de calcium mitochondrial en réponse à différents stimuli. La méthode est basée sur la microscopie par fluorescence de «ratiométrique-pericam 'qui est sélectivement ciblé à la mitochondrie. Ratiométrique pericam est un indicateur de calcium repose sur une fusion de circulairement permuté protéine fluorescente jaune et calmoduline 4. Liaison du calcium à pericam ratiométrique provoque un décalage de son pic d'excitation de 415 nm à 494 nm, tandis que le spectre d'émission, qui culmine autour de 515 nm, reste inchangé. Ratiométrique pericam lie un ion calcium unique avec une constante de dissociation in vitro de ~ 1,7 uM 4. Ces propriétés permettent d'pericam ratiométrique la quantification des changements rapides et à long terme de la concentration de calcium mitochondrial. Par ailleurs, nous décrivons l'adaptation de cette méthodologie à un niveau large champ de microscope d'imagerie calcique avec des jeux de filtres couramment disponibles. L'utilisation de deux agonistes distincts, l'agoniste purinergiques ATP et la drogue staurosporine inducteur d'apoptose, nous démontrons que cette méthode est appropriée pour la surveillance des changements dans la concentration de calcium mitochondrial avec une résolution temporelle de secondes à plusieurs heures. Par ailleurs, nous montrent aussi que pericam ratiométrique est également utile pour mesurer la fission mitochondriale / fragmentation lors de l'apoptose. Ainsi, pericam ratiométrique est particulièrement bien adapté pour continu à long terme de mesure de la dynamique mitochondriale de calcium pendant l'apoptose.
Protocol
1. Pericam-mt transfection et préparation cellulaire.
- Plate cellules HeLa la nuit avant la transfection sur des lamelles de verre stériles placées dans une plaque de culture de 6 puits standard.
- Préparer l'ADN / Lipofectamine 2000 complexes comme suggéré par le fabricant (Invitrogen). Nous utilisons 4 ug de vecteur d'expression ratiométrique-pericam-mt et 10 pi de Lipofectamine 2000 dilué dans 0,5 ml d'Opti-MEM pour chaque puits. Les cellules doivent être confluentes ~ 70% avant la transfection.
- Remplacer HeLa milieux de culture (Dulbecco Modified Eagles moyenne, 10% de FBS, pénicilline / streptomycine) dans chaque puits avec 1,5 mL de la même support sans antibiotiques.
- Ajouter les complexes ADN / Lipofectamine dans chaque puits à transfecter. Mélanger délicatement avec bascule et incuber pendant 4 heures dans un incubateur de culture cellulaire à 37 o C, 5% de CO 2.
- Remplacez sans antibiotique médias avec les milieux de culture avec des antibiotiques. Laisser les cellules d'exprimer pericam ratiométrique pendant 1-2 jours avant l'imagerie.
2. Installation du microscope et de l'acquisition d'images
- Placer une lamelle avec des cellules HeLa dans une chambre d'imagerie appropriés avec une solution d'imagerie: 107mm NaCl, KCl 7,2 mm, 1,2 mm de MgCl2, 1 mM CaCl 2, 11.5mm de glucose, 0,1% d'albumine sérique bovine, et 20 mM HEPES 7,2. Notre laboratoire utilise la chambre cellulaire Attofluor chez Invitrogen. Montez la chambre de l'imagerie dans un stade microscope inversé.
- Trouver une zone d'intérêt contenant une ou plusieurs cellules exprimant pericam ratiométrique utilisant un 40x (ou supérieur) objectif à immersion d'huile. Nous avons constaté que pericam ratiométrique est moins résistant au photoblanchiment à 380 nm, et donc nous utilisons cette longueur d'onde pour identifier les cellules appropriées. Pour les images acquises dans la figure 1, un objectif Nikon Superfluor 40X avec une ouverture numérique 1,3 a été utilisé. Objectifs de grossissement supérieur serait aussi approprié (60-100x). Filtres d'excitation utilisées étaient Chroma Technology filtres D380/30x (380 + / - 30 nm) et D495/10 (495 + / - 5 nm), a été 505DCXR séparatrice (505nm longpass) et filtre d'émission a été HQ535/50m (535 + / - 25nm).
Notre microscope utilisé pour acquérir les images de la figure 1 se compose d'un Nikon TE2000 microscope inversé équipé d'un Roper Scientific Coolsnap HQ caméra CCD refroidie, Ludl MAC6000 rapide du filtre roue et changeur, et une acquisition de données et MetaFluor logiciel d'analyse. Ce protocole peut être adapté à toute norme à large champ de microscope avec des filtres appropriés et un logiciel capable de capturer et de traitement des images ratiométrique. - Configurez le logiciel pour l'excitation double en utilisant les filtres 495 et 380 nm. Le calcium se liant à pericam ratiométrique augmente l'absorbance à 495 nm, donc le ratio devrait être mis en place à 495 nm/380 nm.
Ratiométrique pericam a sans calcium pic d'excitation à 415 nm 4. Dans ce protocole, nous suggérons d'utiliser un filtre à 380 nm seulement parce qu'elle est omniprésente dans la plupart des laboratoires d'imagerie calcique. Si un filtre 410 nm, est disponible, il est préférable de le filtre 380 nm. - Acquérir les images séquentiellement par alternativement passionnante à 495 et 380 nm. Acquérir des images de niveaux de calcium de base pour au moins 30 s avant l'application d'un agoniste via un appareil de perfusion. Marquer le temps d'addition pour chaque agoniste. Les temps d'exposition et les intervalles d'acquisition devrait être optimisé pour éviter photoblanchiment tout en permettant par exemple suffisamment resolution.For temporelle, pour la dynamique de calcium semi-rapides suivis en réponse à une stimulation agoniste, les images ont été acquises toutes les deux secondes dans les figures 1b et les taux d'acquisition C. Bien plus efficace Il est également possible 6. À long terme après l'administration d'imagerie staurosporine a été acquis avec un intervalle plus long (30s) entre les acquisitions (figures 1 D et E).
3. Traitement et analyse des images
- Une fois l'expérience terminée, les images obtenues peuvent être analysées hors ligne. Définir des régions d'intérêt (ROI) dans laquelle vous voulez suivre les changements dans les niveaux de calcium. Utilisez un ROI sélectionnée dans une zone vide du champ de soustraire de fond si nécessaire. Il est à noter que les mitochondries sont très mobiles et dynamiques, et les événements dans une extrapolation mitochondrie unique sur de longues périodes n'est pas toujours possible. Ainsi, compte tenu de la grande mobilité de cet organite dans certains types de cellules, la sélection de ROI doivent être surveillés attentivement. Par ailleurs, comme en témoigne la figure 1, la réponse mitochondries hétérogène à divers stimuli. Il est donc important d'analyser les données hors ligne et de surveiller le placement RO1 sur une base trame par trame. Une description détaillée de la mesure du calcium mitochondrial dans très mobiles des mitochondries a été décrit ailleurs 7.
- Mesure du rapport Obtenu à partir du ROI peut être importé dans Excel ou similaire graphingsoftware. Les données peuvent être présentées comme une trace représentative de l'évolution des taux de calcium mitochondrial dans une seule cellule ou mitochondrie unique, ou en moyenne flsignaux uorescence du ROI plusieurs années. Nous avons également utilisé cette technique pour mesurer la moyenne des niveaux de calcium mitochondrial dans une population de lymphocytes en apoptose induite par Fas ligand 8.
4. Les résultats représentatifs:
Figure 1. (A) la localisation subcellulaire de ratiométrique-pericam-mt. Cette première image montre des cellules HeLa exprimant direct ratiométrique-pericam-mt. La deuxième image montre coloration fluorescente avec mitochondrie sélectif CMXRos colorant rouge Mitotracker. La fluorescence jaune dans l'image fusionnée démontre la co-localisation des ratiométrique-pericam-mt et la fluorescence Mitotracker. (B) Une série de ratio de pseudo (495:380 nm) des images de cellules HeLa exprimant 4 mt-ratiométrique pericam traitées avec 10 mM d'ATP . (C) Quantification des changements dans les niveaux de calcium mitochondrial dans la région d'intérêt (ROI) a indiqué en (B) traités par 10 mM d'ATP. (D) Série de rapport de pseudo (495:380 nm) des images d'une cellule HeLa exprimant mt -ratiométrique pericam traités avec 0,5 uM de staurosporine. Hétérogénéité de la réponse de calcium dans les mitochondries individuels est évident, ainsi que la fragmentation importante des mitochondries de 60 minutes. Certains ont mitochondries augmente oscillatoires en calcium (tête de flèche blanche), alors que d'autres ne montrent pas d'importants changements dans le niveau de calcium (tête de flèche jaune). (E) de quantification de l'augmentation des niveaux mondiaux de calcium mitochondrial dans une seule cellule HeLa après l'induction de l'apoptose par 0,5 uM de staurosporine.
Discussion
Nous présentons ici une méthode très simple pour mesurer le calcium mitochondrial mitochondrial aide ciblée pericam ratiométrique. Comme le montre la figure 1A, en utilisant la norme optiques grand champ sans déconvolution, il est possible de visualiser facilement des mitochondries dans les cellules HeLa individuels avec acceptables signal-bruit. C'est parce que les cellules HeLa, comme la plupart des cellules en culture, s'aplatissent de façon significative lorsque adhérente évitant la nécessité pour la microscopie confocale ou d'autres équipements spécialisés. Nous avons trouvé des résultats similaires dans les cellules Jurkat respectées poly-lysine lamelles revêtement 8. Contrairement aux méthodes d'utilisation de colorants, il est également possible de façon non invasive de surveiller les niveaux de calcium mitochondrial pendant des heures en utilisant des indicateurs de calcium génétiquement codés tels que ratiométrique pericam (figure 1E). Ceci est particulièrement important lors de l'analyse du calcium mitochondrial lors de la mort cellulaire. Par ailleurs, il est également possible de visualiser la fission / fragmentation des mitochondries au cours du processus apoptotique. Comme indiqué dans les figures 1D et E, le traitement des causes staurosporine une lente augmentation de calcium dans les sous-populations de sélectionner des mitochondries qui culmine à 20 minutes. Les taux de calcium redescendre concomitante avec la fragmentation mitochondriale avant de monter à nouveau deux heures après le traitement. Ceci est cohérent avec les ondes lentes en calcium cytosolique induite par le traitement staurosporine mesurée en utilisant Fura-2 9. Ainsi, d'importantes informations cinétiques peuvent être obtenus qui n'est pas possible avec les méthodes employant des mesures statiques. Bien que nous ayons présenté les rapports et les concentrations de calcium n'est pas dans la figure 1, il est possible d'étalonner le capteur in situ afin de calculer les niveaux de calcium absolue 4, 10. Une mise en garde importante à considérer est que pericam ratiométrique est sensible au pH 4, 10. Comme les deux niveaux de pH cytosolique et mitochondrial peut changer de façon spectaculaire lors de l'apoptose 11, c'est une considération importante. Le titrage de pH dans des régions isolées pericam exprimer mitochondries montrent que l'augmentation de [H +] d'émission des augmentations de pericam lorsqu'il est excité à 495 nm, avec peu d'effet sur l'émission stimulée par excitation à 410 nm, une propriété qui a été exploitée pour mesurer simultanément le calcium mitochondrial et pH 12. Ainsi, de façon sélective le contrôle des émissions à 410 nm d'excitation fournit un moyen de surveiller le calcium non ratiometrically mitochondriale avec inquiétude réduite pour le pH. Enfin, le protocole présenté ici ne requiert que l'accès à un microscope standard avec des filtres à épifluorescence largement disponibles, ce qui rend cette technique accessible à la plupart des laboratoires.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Atsushi Miyawaki de nous avoir fourni la construction d'expression ratiométrique-pericam-mt. Ce travail a été soutenu par des subventions GM081685 des National Institutes of Health (DB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon Instruments | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. |
| Imaging Software | Molecular Devices | Metafluor | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 |
References
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