Summary
Bu protokol, mitokondriyal kalsiyum akıları floresan görüntüleme ile gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem açıklanır. Yöntemi seçici mitokondri ifade dairesel permutated bir çift uyarma YFP tabanlı oranlı metrik kalsiyum sensör (oranlı metrik pericam-mt) yararlanır.
Abstract
Çeşitli uyaranlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu Dinamik değişiklikler, proliferasyon, diferansiyasyon ve apoptosis 1 gibi birçok hücresel süreçleri düzenler. Mitokondri, kalsiyum birikimi apoptozis sırasında serbest pro-apoptotik faktörlerin sitoplazmada 2 içine mitokondri teşvik etmektedir. Bu nedenle, doğrudan canlı hücrelerde apoptozis sırasında in situ mitokondriyal kalsiyum ölçmek için ilgi . Yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme çift uyarma oranlı metrik ve oranlı metrik olmayan sentetik kalsiyum gösterge boya ile yüklü hücreler, hücre içi kalsiyum sinyal çeşitli yönlerini incelemek için güvenilir ve çok yönlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Sitozolik kalsiyum akıları ölçerek, bu teknikleri kullanarak oldukça basittir. Ancak, rhod-2 ve rhod-FF gibi sentetik kalsiyum göstergeleri kullanarak sağlam hücreler intramitochondrial kalsiyum seviyelerini ölçmek daha zor. Mitokondri hedeflenen Sentetik göstergeleri mitokondriyal kalsiyum tekrarlayan artar yanıtları köreldiğini ve mitokondriyal morfolojisi 3 bozabilir. Ayrıca, sentetik göstergeler, uzun vadeli denemeler için uygunsuz hale getiren birkaç saat içinde mitokondri sızıntısı eğilimindedir. Böylece, mitokondriye hedefleyen yeşil floresan protein (GFP) 4 veya aequorin 5 dayalı genetik olarak kodlanmış olan kalsiyum göstergeleri, mitokondriyal kalsiyum dinamikleri ölçümü önemli ölçüde kolaylaştırmıştır. Burada, farklı uyaranlara tepki olarak mitokondriyal kalsiyum akıları gerçek zamanlı ölçümü için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Seçici mitokondri hedeflenen 'oranlı metrik pericam' floresan mikroskopi yöntemi dayanıyor. Oranlı metrik pericam dairesel karılmış sarı floresan protein ve kalmodulin 4 bir füzyon dayalı bir kalsiyum göstergesi. Oranlı metrik pericam kalsiyum bağlayıcı emisyon spektrumu, yaklaşık 515 nm zirveleri, değişmeden kalırken, 415 nm ile 494 nm eksitasyon zirve kaymasına neden olur. Oranlı metrik pericam ~ 1.7 mcM 4 in vitro sabit bir disosiasyon tek bir kalsiyum iyonu bağlar. Oranlı metrik pericam Bu özellikler, mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonu hızlı ve uzun vadeli değişimler miktarının izin verir. Ayrıca, bu metodoloji, yaygın olarak kullanılan filtre setleri ile standart bir geniş alan kalsiyum görüntüleme mikroskop adaptasyonu açıklar. Iki ayrı agonistleri purinerjik agonist ATP ve apoptozis indükleyici ilaç staurosporine kullanarak, saat saniye zamansal çözünürlüğe sahip mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri izlemek için bu yöntem uygun olduğunu göstermektedir. Ayrıca, biz de oranlı metrik pericam apoptozis sırasında mitokondrial fizyon / parçalanma ölçmek için de yararlı olduğunu göstermektedir. Böylece, özellikle de oranlı metrik pericam apoptozis sırasında mitokondriyal kalsiyum dinamikleri sürekli uzun vadeli ölçümü için uygundur.
Protocol
1. Pericam mt Transfeksiyon ve Hücre hazırlanması.
- Levha HeLa hücrelerinde standart 6 kuyu kültür plaka yerleştirilen steril cam lamelleri transfeksiyon önce gece.
- DNA / Lipofectamine 2000 kompleksleri üreticisi (Invitrogen) tarafından önerildiği gibi hazırlayın. Biz oranlı metrik pericam-mt ifade vektör 4 mg ve her bir kuyu için 0.5 ml Opti-MEM seyreltilmiş Lipofectamine 2000 10 mcL kullanın. Hücreleri ~% 70 konfluent transfeksiyon önce olmalıdır.
- 1.5 mL antibiyotik olmadan aynı medya ile her bir kuyunun HeLa kültür ortamı (Dulbecco'nun modifiye kartal orta,% 10 FBS, penisilin / streptomisin) değiştirin.
- DNA / Lipofectamine kompleksleri, her iyi transfekte ekleyin. 37 o C,% 5 CO 2 hücre kültürü inkübatör 4 saat inkübe ile sallanan ve hafifçe karıştırın.
- Antibiyotikler ile kültür ortamı ile antibiyotik ücretsiz medya değiştirin. Hücreleri görüntüleme 1-2 gün önce oranlı metrik pericam ifade etmek için izin verin.
2. Mikroskop Kurulum ve Image Acquisition
- HeLa hücreleri ile bir lamel: 107mm NaCl, 7.2mm KCl, 1.2mm MgCl 2, 1mm CaCl 2, 11.5mm glikoz,% 0.1 sığır serum albümin ve 20mm Hepes 7.2 görüntüleme çözümü ile uygun bir görüntüleme odasının içine yerleştirin. Laboratuvarımız Invitrogen Attofluor hücre odasına kullanır. Ters bir mikroskop aşamada görüntüleme odasının monte edin.
- Faiz oranlı metrik pericam bir 40x (veya üstü) immersiyon yağı hedefi kullanarak ifade bir ya da daha fazla hücre içeren bir alan bulun. Biz oranlı metrik pericam 380 nm dalga photobleaching daha az dirençli olduğunu buldular ve böylece biz uygun hücreleri tanımlamak için bu dalga boyu kullanabilirsiniz. Şekil 1 'de elde edilen görüntüler için, 1.3 sayısal diyafram ile Nikon Superfluor 40X objektif kullanıldı. Yüksek büyütme hedefleri de (60-100x) uygun olacaktır. Krom Teknoloji filtreler D380/30x kullanılan Tahrik olma filtreler (380 + / - 30 nm) ve D495/10 (495 + / - 5 mil), ışın dağıtıcı 505DCXR (505nm longpass) ve emisyon filtresi HQ535/50m (535 + / - - 25nm).
Şekil 1 görüntüleri elde etmek için kullanılan mikroskop bir Roper Bilimsel Coolsnap HQ CCD kamera, Ludl MAC6000 hızlı filtre çarkı ve değiştirici, soğutmalı bir MetaFluor veri toplama ve analiz yazılımı ile donatılmış Nikon TE2000 inverted mikroskop oluşur. Bu protokol, uygun filtre ve oranlı metrik görüntü yakalama ve işleme yeteneğine sahip yazılımlar ile herhangi bir standart geniş alan mikroskobu adapte edilebilir. - 495 ve 380 nm filtreleri kullanarak çift uyarma için yazılımı kurun. Oranlı metrik pericam bağlayıcı Kalsiyum 495 nm'de absorbans artar, böylece oranı, 495 nm/380 nm için ayarlanmış olmalıdır.
Oranlı metrik pericam 415 nm 4 kalsiyum uyarma tepe vardır. Çoğu kalsiyum görüntüleme laboratuvarlarda her yerde, çünkü sadece bu protokolde 380 nm filtre kullanmanızı öneririz. 410 nm filtre varsa, 380 nm filtre için tercih edilir. - Sırayla 495 ve 380 nm alternatif heyecan verici görüntüler elde. Perfüzyon aparatı ile agonist uygulamadan önce en az 30 için başlangıç kalsiyum düzeylerinin görüntüler elde. Her agonist için ek süre işaretleyin. Pozlama süreleri ve satın alma aralıkları agonist stimülasyon yanıt izlenen yarı-hızlı kalsiyum dinamikleri için hala yeterli zaman resolution.For Örneğin izin verirken, photobleaching önlemek için optimize edilmelidir görüntüleri Şekil 1B ve C Çok daha hızlı satın alma oranları her iki saniyede elde edildi ayrıca 6 mümkündür. Staurosporine uygulamadan sonra Uzun vadeli görüntüleme satın almalar arasında uzun bir zaman aralığı (30s) (Şekil 1 D ve E) ile satın alınmıştır.
3. Görüntü İşleme ve Analizi
- Deney tamamlandıktan sonra elde edilen görüntüler çevrimdışı analiz edilebilir. Kalsiyum düzeyleri değişiklikleri izlemek istediğiniz ilgi alanları (ROI) tanımlayın. Alanında boş bir alan içinde gerekirse arka plan çıkarmak için seçilen bir yatırım getirisi kullanın. Mitokondri oldukça hareketli ve dinamik olduğunu kaydetti ve uzun süre boyunca tek bir mitokondride tahminde olaylar her zaman mümkün değildir olmalıdır. Böylece, bazı hücre tipleri bu organel yüksek motilite dikkate alınarak, ROI seçimi dikkatle izlenmelidir olmalıdır. Ayrıca, Şekil 1, çeşitli uyaranlara heterojen mitokondri yanıt kanıtlandığı gibi. Verileri çevrimdışı analiz etmek ve bir kare-kare bazında yerleştirme RO1 izlemek için bu nedenle önemlidir. Son derece hareketli mitokondri mitokondriyal kalsiyum ölçüm ayrıntılı bir açıklaması başka bir yerde 7 tarif edilmiştir.
- ROI Elde Edilen oranı ölçümleri, Excel ya da benzer graphingsoftware ithal edilebilir. Veriler tek bir hücre ya da tek mitokondri mitokondriyal kalsiyum düzeyleri değişiklikleri temsil eden bir eser olarak sunulan veya fl ortalama olabilirbirkaç ROI uorescence sinyalleri. Ayrıca, Fas ligand 8 apopitozu geçiren lenfositlerin bir nüfusa ortalama mitokondriyal kalsiyum seviyelerini ölçmek için bu tekniği kullandım .
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1. (A) oranlı metrik-pericam mt hücre içi lokalizasyonu. Bu ilk görüntü oranlı metrik-pericam-mt ifade canlı HeLa hücre gösterir. Ikinci görüntü mitokondri seçici boya MitoTracker Kırmızı CMXRos floresan boyama gösterir. (B) Birleştirilen görüntüyü sarı floresan oranlı metrik-pericam-mt ve MitoTracker floresan co-lokalizasyon göstermektedir. Pseudocolor oranı (495:380 nm), 10 mM ATP ile tedavi mt-oranlı metrik pericam ifade 4 HeLa hücrelerinin görüntüleri bir dizi (C) ilgi bölgesi (ROI) mitokondriyal kalsiyum düzeylerindeki değişikliklerin Niceleme Pseudocolor oranı (495:380 nm) mt ifade eden bir HeLa hücre görüntüleri (B) (D) 10 mM ATP ile tedavi edilir. Serisi belirtilen oranlı metrik pericam 0.5 mcM staurosporine ile tedavi edildi. Bireysel mitokondride kalsiyum yanıt olarak heterojenite belirgin yanı sıra 60 dakika mitokondri önemli parçalanma. Diğerleri kalsiyum seviyesi önemli değişiklikler (sarı ok başı) görünmüyor, ancak bazı mitokondri, kalsiyum (beyaz ok başı) salınım artışlar var. Apoptozis indüksiyonu sonra tek bir HeLa hücre küresel mitokondriyal kalsiyum düzeyleri artar (E) Niceleme 0.5 mcM staurosporine.
Discussion
Burada mitokondriyal hedefli oranlı metrik pericam kullanarak mitokondriyal kalsiyum ölçmek için çok basit bir yöntem mevcut. Olarak kabul edilebilir sinyal-gürültü oranı ile kolayca HeLa hücreleri bireysel mitokondri görmek mümkündür, hiçbir deconvolution standart widefield optiği kullanarak, Şekil 1A gösterilmiştir. Bu zaman yapışık konfokal mikroskopi veya diğer özel ekipman için gerek kalmayabilir HeLa hücrelerinde, kültür hücreleri gibi, önemli ölçüde düzleştirmek çünkü. Biz poli-lizin kaplı lamelleri 8 yapıştırılır Jurkat hücrelerinde benzer sonuçlar bulduk. Boyalar kullanarak metodolojileri aksine, non-invaziv oranlı metrik pericam (Şekil 1E) gibi genetik olarak kodlanmış olan kalsiyum göstergeleri kullanarak saat mitokondriyal kalsiyum düzeylerinin izlenmesi de mümkündür. Hücre ölümü sırasında mitokondriyal kalsiyum analiz ederken bu özellikle önemlidir. Ayrıca, apoptotik süreci sırasında fisyon / mitokondri parçalanması görselleştirmek için de mümkündür. Şekil 1D ve E görüldüğü gibi, staurosporine tedavi, 20 dakika mitokondri hangi doruklarına seçin alt popülasyonlar kalsiyum yavaş bir artışa neden olur. Kalsiyum düzeyleri tedavi 2 saat sonra tekrar gitmeden önce tekrar mitokondriyal parçalanma ile eş zamanlı aşağı gidin. Bu Fura-2 9 kullanarak ölçülen staurosporine tedavi ile indüklenen sitozolik kalsiyum yavaş dalgaları ile tutarlıdır. Böylece, önemli kinetik bilgiler statik ölçümler istihdam yöntemleri ile mümkün değildir elde edilebilir. Oranları ve kalsiyum konsantrasyonları Şekil 1'de sunulan olmasına rağmen, mutlak kalsiyum düzeyleri 4, 10 hesaplamak için in situ sensörü kalibre etmek mümkündür. Dikkate alınması gereken önemli bir ihtar oranlı metrik pericam pH 4, 10 duyarlı olmasıdır . Hem sitozolik ve mitokondriyal pH seviyeleri apoptozis 11 sırasında dramatik bir biçimde değiştirebilir, bu önemli bir husustur. Izole mitokondri ifade pericam pH Titrasyon göstermek artan [H +] 410 nm eksitasyon, aynı anda hem mitokondriyal kalsiyum ölçmek için kullanılabilir bir özellik tarafından uyarılmış emisyon üzerinde çok az etkisi ile artar, 495 nm'de heyecan pericam emisyon ve pH 12. Böylece, seçici 410 nm eksitasyon emisyon izleme için daha az endişe ile pH olmayan ratiometrically monitör mitokondriyal kalsiyum için bir araç sağlar. Son olarak, burada sunulan protokol, böylece bu tekniği en laboratuarlara erişilebilir hale yaygın kullanılan filtreler ile standart bir epifluorescent mikroskop erişim gerektirir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Atsushi Miyawaki oranlı metrik pericam mt ifade inşa bize sağladığı için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (DB) hibe GM081685 tarafından da desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon Instruments | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. |
| Imaging Software | Molecular Devices | Metafluor | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Hajnoczky, G. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Miyawaki, A. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Shimozono, S. Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein. Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).
- Wozniak, A. L. Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).
- Boehning, D. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).
- Csordas, G. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
